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技术支持

古朵生物:WesternBlot样品处理方法

发布时间:2016-10-11   点击次数:642次

    WesternBlot样品处理方法


   上海古朵品牌生化试剂供应商!

   1.培养的细胞(定性):
    (1)去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍(冷的PBS有可能使细胞脱落)。
    (2)对于6孔板来说每孔加200~300μl,60~80℃的1×loadingbuffer。
    (3)100℃,1min。
    (4)用细胞刮刮下细胞后在EP管中煮沸10min,期间vortex2~3次。
    (5)用干净的针尖挑丝,如有团块则将团块弃掉,如果没有团块但有拉丝现象,则可以将EP管置于0℃后在14000~16000g离心2min,再次挑丝。若无团块也无丝状物但溶液有些粘稠,可通过使用1ml注射器反复抽吸来降低溶液粘滞度,便于上样。
    (6)待样品恢复到室温后上样。


    2.培养的细胞(定量):
    (1)去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍(冷的PBS有可能使细胞脱落)。
    (2)加入适量的冰预冷的裂解液后置于冰上10~20min。
    (3)用细胞刮刮下细胞,收集在EP管后超声(100~200w)3s,2次。
    (4)12000g离心,4℃,2min。
    (5)取少量上清进行定量。
    (6)将所有蛋白样品调至等浓度,充分混合沉淀后加loadingbuffer后直接上样,剩余溶液(溶于1×loadingbuffer)可以低温储存,-70℃一个月,-20℃一周,4℃1~2天,每次上样前98℃,3min。


    3.组织:
    (1)匀浆对于心肝脾肾等组织可每50~100mg加1ml裂解液,肺100~200mg加1ml裂解液。可手动或电动匀浆。注意尽量保持低温,快速匀浆。
    (2)12000g离心,4℃,2min。
    (3)取少量上清进行定量。
    (4)将所有蛋白样品调至等浓度,充分混合沉淀加loadingbuffer后直接上样,剩余溶液(溶于1×loadingbuffer)可以低温储存,-70℃一个月,-20℃一周,4℃1~2天,每次上样前98℃,3min。


    裂解液配方:Tris-Cl(pH7.4)20mM,EDTA1mM由于蛋白酶抑制剂可影响蛋白定量,且新鲜蛋白很少降解,故可不加,如加按建议比例即可。提取磷酸化的蛋白还需加Na3VO40.1mM及NaF25mM。


    1×loadingbuffer配方:10%甘油,50mMTris·Cl(pH6.8),2%β-巯基乙醇,0.2~0.5‰溴酚蓝,2%或5%的SDS。Buffer可配成2×~5×,注意SDS终浓度勿超过10%。对于心脏,肌肉等碎屑较多的组织可用5%的SDS,肝肾等组织2%即可。


    上海古朵生物主营产品有标准品、细胞株、ELISA试剂盒、染色液、抗体等,价格优惠,质量保证!并有完善的技术团队,帮助解决售后问题,让您无后顾之忧!本公司产品仅用于科研使用,不供临床实验,咨询!

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