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技术支持

上海远慕为您讲述:大鼠乳鼠成骨细胞培养

更新时间:2017-07-07   点击次数:2335次

大鼠乳鼠成骨细胞培养培养可以:(1)获得大鼠乳鼠成骨细胞;(2)用于骨修复的细胞学机制研究。

实验方法:

酶消化法


实验方法原理取材于出生2~3d小鼠颅骨,以含20%胎牛血清的DMEM培养液进行培养,采用胶原酶消化法分离成骨细胞,并进行细胞接种与传代。采用胶原酶消化法分离培养成骨细胞是一种可靠、简便、快速的细胞原代分离培养方法。

实验材料:

SD大鼠

试剂、试剂盒

F12*培养液胰蛋白酶Ⅱ型胶原酶酒精

仪器、耗材

手术器械磁力搅拌器

实验步骤

一、实验步骤

1.拉颈处死24小时内新生的SD大鼠,75%乙醇浸泡5min,取出头盖骨,分离顶骨和额骨,冰生理盐水液反复洗涤大鼠乳鼠颅盖骨标本除去脂肪组织及残留血,放入另一盛有F12*培基液的培养皿中再洗涤,将颅骨剪成2~5mm2碎片,将洗涤过的骨碎片用0.25%胰蛋白酶2ml预消化15min,以清除纤维组织细胞,弃去上清液(其中主要含成纤维细胞)。

2.然后以0.1%Ⅱ型胶原酶10ml,在37℃环境中消化20分钟,室温下磁力搅拌消化20分钟。静置数分钟,收集消化液,室温下以1200rpm离心10分钟。去除上清液,用20%胎牛血清的F12培养液4ml悬浮细胞,接种于75ml培养瓶中,补培养液8ml使每瓶液体量达到12ml;对静置后沉淀部分可再重复以胶原酶消化20分钟、磁力搅拌消化15分钟、离心10分钟,将获得的3瓶细胞放置于二氧化碳培养箱,在5%CO2,95%空气,37℃温度下培养,24小时后可见细胞贴壁生长,胞质开始伸展,换新鲜培养液,以后每隔48小时换培养液(注:消化视具体情况而定,也可多消化1遍)。

3.原代培养一般接种后第7天能长满。传代时,取生长良好、贴壁松紧适度的成骨细胞1瓶,弃去培养液,传代时先以PBS冲洗2遍,加0.25%胰酶1ml,室温下消化3~5分钟,将胰蛋白酶液弃去,加F12培养液充分吹打8-10分钟。将已消化的细胞收集、合并,计数;用F12*培基调节至细胞浓度为合适浓度。一般取2-5代成骨细胞进行实验。代数太多,细胞老化或者分化明显。

二、结果

如图所示,成骨细胞的形状和成纤维细胞非常相似,但是不同的是,比成纤维细胞更不容易消化,尤其是传代次数多,细胞老化的时候,非常难消化,并且不易消化成单个细胞。

三、鉴定的方法

1.碱性磷酸酶(ALP)活性检测

2.骨玻璃样蛋白(BGP)检测

3.矿化结节检测

其他

一、讨论

成骨细胞包绕在硬组织中,致使处理困难,可采用骨组织块法、酶消化法、骨膜组织块法、骨髓培养法以及薄层骨片经EDTA处理并经胶原酶消化,均可培养出成骨细胞。体外培养的成骨细胞保持有骨组织细胞的某些特征。据文献报道,不同方法培养的成骨细胞形态是不同的[1]。

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