原代细胞复苏和传代流程详述

一、实验前准备工作：

1、培养瓶的包被：包被液如多聚赖氨酸（PLL，ScienCell品牌，货号0403或0413）或纤维粘连蛋白（BPF，ScienCell品牌，货号8248），以无菌水稀释至2 ug/cm2的浓度包被培养瓶。37度孵箱1小时或4度过夜，从包被好的培养瓶中回收多聚赖氨酸，并用无菌水洗涤培养瓶2遍。包被好的培养瓶不要放置超过24小时，其中的包被液可吸出重复使用2-3次，注意不要污染。

2、*培养基的配置：以内皮细胞培养基（ECM，ScienCell品牌，货号1001）为例，把配套的胎牛血清（FBS，ScienCell品牌，货号0025）、生长因子（ECGS，ScienCell品牌，货号1052）和双抗（P/S，ScienCell品牌，货号0503）加入基础培养液（ECM，ScienCell品牌，货号1001）中。重新贴好标签，并混匀培养基。

二、原代细胞复苏方法：
1、从液氮中取出原代细胞冷冻管，迅速投入37～38 ℃水浴中，其间可以轻轻转动细胞，加快融化速度，大约需要1分钟时间。
2、5分钟内用培养基稀释至原体积的10倍以上，加入培养瓶中，再用1ml培养基洗涤细胞冻存管，保证细胞都被加入培养瓶中，静置于孵箱，12-16小时后更换培养基（除去DMSO）。以后每2天换一次液，保证细胞状态良好。

三、原代细胞传代方法：酶消化法
当细胞生长至70-80%左右可以传代，传代比例以1:2或1:3为佳。具体方法如下：
1、弃去培养瓶中培养基，用PBS洗涤培养瓶2遍，加入0.25%的胰酶消化液（Trypsin-EDTA，ScienCell品牌，货号0103），以消化液能覆盖整个瓶底为准。37度孵育4分钟左右，轻拍培养瓶侧面，显微镜下观察细胞消化情况，直到80%细胞呈现圆形。
2、细胞消化好后，加入胰酶中和液（TNS，ScienCell品牌，货号0113），并轻轻摇动培养瓶，形成细胞悬液，然后将细胞和培养基转移至离心管中，1000rpm离心5分钟。

3、弃去上清液，以1-2ml新鲜培养基重新悬浮细胞并吹打均匀，接种于包被好的新培养瓶中，瓶中已有10ml左右的培养基，放入培养箱中培养，每2天更换培养基。