真菌常用染色法及注意要点

     为了让观察更加清晰，让需要观察到的现象通过染色暴露出来，或者通过通过染色可以实现某些鉴别等功效，实验员进行微生物制片时都会进行染色，一般常用的细菌染色方法有：

1.六胺银法(GMS法)

我们在实验中对Grocott-Go-mori六胺银法,作如下改进。(1)用8%铬酸代替原法的5%铬酸,氧化时间由1h减为20min;(2)六胺银工作液中原法是用六胺银贮备液25ml,我们减为10ml,这样在电热恒温箱作用下切片就不容易过度染黑。进行六胺银法染色时,取高身5片染色缸盛六胺银工作液,置入58~60恒温箱内预热30min,把已脱蜡并经铬酸氧化后至水的待染切片,用蒸馏水洗2次后移入已预热的六胺银工作液(加盖),约20min后取出肉眼观察,如见切片稍呈淡黄色,即取出切片用蒸馏水洗后置显微镜下观察有否菌体出现,如有黄棕色的菌体出现,则需按其深浅,以后每隔5~10min再取出镜检以控制菌体着色深度,至适度的棕黑色为宜(此步骤很重要),取出切片转入下一步骤。如用水浴箱孵育,度应调至50预热5min左右,若调至60时,则作用较快,切片很快变黑,难以控制,而染色缸壁有时也呈银镜反应,六胺银工作液变灰黑色而失效。

六胺银法可适用于多种真菌染色,但必需掌握孵育时间。当染曲菌和毛霉菌时,如显色太淡,菌丝灰黄不明显,难以观察曲菌菌丝的分隔。如显色太深,菌丝呈索状,看不清菌丝的两侧壁,也看不清菌丝有否分隔;新型隐球菌染色时,如显色太浅,隐球菌的荚膜不明显,小的隐球菌不易发现。如显色过度,分不清荚膜和菌体;组织胞浆菌如显色过度,常看不清菌壁,而是一团团的黑点;马尔尼菲青霉菌,六胺银法是li想的方法。

在染色时更要掌握好温度和时间,才能显示出少数椭圆形或香肠状细胞中的横壁,这是诊断马尔尼菲青霉菌的形态学特征。六胺银法染色,可使网状纤维和纤维蛋白丝也染成灰棕色,只要仔细辨别即不会与曲菌和毛霉菌混肴。后复染一般用橙黄G染1~2s。对于肺曲菌病,可用Mayer苏木精染核后再复染伊红或固绿能获得满意的结果,可以看到曲菌的形态和其与肺泡、小支气管和软骨之间的关系。但对马尔尼菲青霉菌,还是单纯用橙黄G复染为佳,因为底色清晰,能更好的发现椭圆形或香肠状细胞和其横壁。此法染色的玻片标本数十年后都不会褪色。

2.碘酸无色品红法(PAS法)

此法的主要染液为无色品红液(又称Schiff试剂),我们是根据McManus的热配法,其配制步骤稍多,如能购到合适的偏重亚硫酸钠,配制较易成功,配妥后密封置冰箱可保存约1年。此法可用于组织胞浆菌染色,也可用于白色念珠菌、曲菌和新型隐球菌的染色。染色前先从冰箱取出无色品红液,放置约30min使其恢复至室温,倾入5片染色缸,把已脱蜡至水并经高碘酸氧化的玻片再用蒸馏水洗2次后移入无色品红液内(加盖),置于暗处作用15~20min。此法染真菌,一般不会过染。无色品红液在不用时置于4°冰箱保存,临用前取出恢复至室温使用。一瓶无色品红液,可反复使用多次,至呈红色才倾去换新液。染色后可用Mayer苏木精浅染胞核。无色品红液在冬季室温低于15时,作用缓慢,这时应把无色品红液置入20~30的水中加温即可用,但水温不宜超过30,因温度过高无色品红易变成红色而失效。

3.色品红醛品红法(Gridley法)

此法与PAS法相似,但它是用铬酸代替高碘酸氧化,切片与无色品红反应后,再经醛品红液处理,作用是增强染色。此法的染色效果,一是基于无色品红的配制是否得宜,另一是基于醛品红液的配制是否理想。根据我们的经验,配制醛品红时,所用的三聚乙醛应新鲜,太陈旧和经多次开瓶取用的都不好。其次是配制时的室温和成熟时间,室温在25~30时,置放2d可以成熟,即由配制时的红色液转变为深紫色。若室温过低时可稍加温置于暖处。此外,配试剂时要选用纯度较高的碱性品红和盐酸。醛品红成熟后置放4°冰箱可保存较长时间。此方法染色不会过染,对染曲菌和白色念珠菌都很理想。

4.尔辛蓝法(AB法)

阿尔辛蓝法的染液配制简单,染色步骤简易。阿尔辛蓝是一种铜酞花青染液,易溶于水,商品有Alcianblue8GS和Alcianblue8GX,两种皆可用,但后者的特异性强,颜色鲜艳,通常配成两种不同pH值的染液,染真菌应用pH25染液(用3%冰醋酸100ml加入阿尔辛蓝1g配成),染色时间15~20min,此染液稳定,置4度冰箱可保存1~2年。此法把新型隐球菌的荚膜染成深蓝色,菌体淡蓝色或无色,其底色可用伊红复染即可,此染法标本不褪色,可长期保存。

5.液胭脂红法(Mucincarmine法)

黏液胭脂红法所用贮备液的配制要经过煮沸,其中所用的无水氯化铝较难保存,开瓶取用后需立即认真用蜡密封瓶口,否则很快吸潮失效。在配成贮备液后,放4°冰箱保存可使用约半年。使用时取贮备液1份,加蒸馏水4份稀释混合后应用,染色时间20~30min,一般不会过染。有些专书介绍用贮备液直接染色而不用稀释液,这样染色时间可缩短,我们认为用贮备液直接染色有时染色不均匀,所以还是推荐用稀释液染色,染色后无需分化,操作简易。在染胞核可用Mayer苏木精液或Harris苏木精液,避免用Ehrlich苏木精染核,因后者可把荚膜淡染,这就妨碍下一步黏液胭脂红的着色。此法把新型隐球菌的荚膜染成玫瑰红色,极易诊断,染色后标本可长期保存不易褪色。

在外检标本中,真菌感染不少见,如能根据其形态结构,辅以特殊染色,是不难诊断的。总的来说,组织胞质菌,采用PAS法,在苏木精浅染核后即可观察鉴定。如用六胺银法,配以橙黄G复染底色则很清晰;马尔尼菲青霉菌,可用PAS法,但较理想的是用六胺银法,配以橙黄G复染,此法染色的关键是银液浸染时间要恰当;新型隐球菌因菌体外周有一含黏多糖的荚膜,因而需选用黏液胭脂红法或阿尔辛蓝法,前者把荚膜染成玫瑰红色,后者把荚膜染成深蓝色,只要有一个比较典型的真菌被黏液胭脂红或阿尔辛蓝着染,就可作为诊断依据;对于曲菌和毛霉菌,用六胺银法都能把菌丝染得很清晰。曲菌染色也可选用PAS法或无色品红醛品红法,但此两法对毛霉菌则染色不佳;白色念珠菌首xuan是无色品红醛品红法,其次PAS法和六胺银法也很理想;放线菌用HE法染色即可观察,菌体中央部分被苏木精染成蓝紫色,周边部的胶质样鞘被伊红染成红色。必要时可作Gram法染色,菌丝为阳性,胶质样鞘阴性。