一步步解剖WB实验操作

一． 高背景
1. 原因：封闭不好，一抗浓度高，洗膜时间和次数不够；
2. 优化：增加封闭时间，降低一抗浓度，增加洗膜时间和次数；
3. 解析：高背景是 WB 中zui常见出现的问题，如果目的条带单一清晰，其他地方出现均一的背景，可以提高吐温比例，洗膜 5 min*5 次或者 10 min*3 次，不要图快肆意改时间和次数；如果出现非均一性背景，实验过程中要保持膜不被干；严格按照实验操作 SOP，养成好的实验习惯。

二. 空白片
1. 原因：比较多，zui可能是一抗加错了，或者稀释时没取到亦或原管抗体没有混匀，再有可能二抗种属加错了，例如常见是兔的加成鼠的；转膜电压电流时间等；
2. 优化：仔细检查抗体是否加错，核实转膜设置没有问题；
3. 解析：胶片上一点信号都没有，多数情况是抗体加错了；如果中间出现了微弱的条带，可能原因是蛋白上样量太少，一抗浓度过低，ECL 发光液稀释过高或失效。若转膜出现了失误，比如膜放反了，肯定白片。

三． 非特异性条带
1. 原因：一抗有非特异性与蛋白结合；
2. 优化：更换一抗或参考「高背景」；
3. 解析：此种情况多数是因一抗不好，换一支抗体；设置好对照组区分目的条带；还有可能是一抗浓度过高引起的非特异性结合。

四． 条带有边缘规则的白圈
1. 原因：转膜时膜和胶之间存在气泡；
2. 优化：转膜前去掉膜和胶之间的气泡；
3. 解析：赶气泡太容易，省略。

五. 条带中间出现白斑点
1. 原因：底物消耗过快，中间区底物消耗完不发光了；
2. 优化：降低蛋白量，降低一抗和二抗的浓度；
3. 解析：快速操作，在中间部位底物消耗之前就把胶光片定影出来，一般实验员很难把控制；从降低蛋白量，降低一抗二抗浓度入手。

六. 出现黑点
1. 原因：膜上其他部位与一抗或者二抗非特异性结合；
2. 优化：封闭用的牛奶一定要纯并且*溶解，封闭后至少洗膜一次；
3. 解析：确定封闭牛奶*溶解，否则封闭时会导致不溶性颗粒附着在膜上，在发光时膜上会出现黑点；建议在牛奶溶解之后静止三分钟，轻取上层牛奶液进行封闭，封闭结束常规洗膜一次；孵育一抗或二抗时，需要加牛奶的也请参照此操作。

七. 条带拖尾
1. 原因：蛋白量太大，一抗浓度偏高和孵育时间太长；
2. 优化：根据实验需求调整上样蛋白量，调整一抗浓度和时间；
3. 解析：这种情况也是常见问题，上样蛋白量一般会做预实验避免；还有容易发生的是一抗浓度太高，作用时间太长引起的，品牌一抗都有稀释比例建议；再个质量好的一抗直接 37 度孵育半小时就好，无需孵育过夜；再强调一遍洗膜千万不要偷懒，次数和时间洗到位，不要担心把抗体和蛋白洗掉没那么脆弱。

八. 条带变形或奇型
1. 原因：配置胶有问题，胶中存在气泡或者某不溶性颗粒，电泳电流不均一；
2. 优化：配胶过程中要小心，使用无杂质的液体。
3. 解析：多数实验室使用设备都有些年限，比如配胶用的海绵垫或塑胶条等，用久了不密封出现漏液漏气；各 buffer 要注意不要有杂质；不使用边缘效应孔上样。

九. 其他问题
1. 条带连成一片。多数原因是上样量过多，其次是样品弥散或中途停止了电泳；
2. 条带偏高或者偏低。常有可能是蛋白有修饰现象；还有可能是胶的浓度与目的蛋白的浓度不对应，例如说 100KD 以上的蛋白用的 12% 胶跑，或者说 20KD 的蛋白用的 6% 胶跑；再是蛋白有降解，会在比原来位置低的地方出现主带，跟着出现一些其他条带，明显现象是所有的条带比正常的都低，且条带模糊不清晰。