半定量RT-PCR的实验原理和方法步骤

    RT-PCR将以RNA为模板的cDNA合成同PCR结合在一起，提供了一种分析基因表达的快速灵敏的方法。RT-PCR用于对表达信息进行检测或定量。另外，这项技术还可以用来检测基因表达差异或不必构建cDNA文库克隆cDNA。RT-PCR比其他包括Northern印迹、RNase保护分析、原位杂交及S1核酸酶分析在内的RNA分析技术，更灵敏，更易于操作。

    RT-PCR的模板可以为总RNA或poly(A)+选择性RNA。逆转录反应可以使用逆转录酶，以随机引物、oligo(dT)或基因特异性的引物（GSP）起始。RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。在两步法RT-PCR中，每一步都在*条件下进行。cDNA的合成首先在逆转录缓冲液中进行，然后取出1/10的反应产物进行PCR。在一步法RT-PCR中，逆转录和PCR在同时为逆转录和PCR优化的条件下，在一只管中顺次进行。

    实验步骤：
    Trizol法RNA提取步骤
    1、提取总RNA
    2、逆转录反应
    3、PCR反应

    以下实验步骤仅供参考：
    1 样品RNA的抽提
    ①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其*溶解。
    ②两相分离
    每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的lv仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚lv仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。
    ③RNA沉淀
    将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积yi丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm
    离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
    ④RNA清洗
    移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。
    ⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。
    ⑥溶解RNA沉淀
    溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其*溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。

    2 RNA质量检测
    1）紫外吸收法测定
    先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液
    浓度和纯度。
    ① 浓度测定
    A260下读值为1表示40 μg RNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40
    μg/ml。具体计算如下：
    RNA溶于40 μl DEPC水中，取5ul，1:100稀释至495μl的TE中，测得A260=0.21
    RNA 浓度=0.21 ×100 ×40 μg/ml=840 μg/ml 或 0.84 μg/μl
    取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 μl，剩余RNA总量为：
    35 μl × 0.84 μg/μl=29.4 μg
    ②纯度检测
    RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。
    2）变性琼脂糖凝胶电泳测定
    ①制胶
    1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60℃，10 ml的10× MOPS电泳缓冲液和18 ml的37% 甲quan溶液(12.3
    M)。
    10×MOPS电泳缓冲液
    浓度    成分
    0.4M    MOPS，pH 7.0
    0.1M    乙酸钠
    0.01M    EDTA
    灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25
    μl溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1×MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。
    ②准备RNA样品
    取3μgRNA，加3倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10μg/ml。加热至70℃孵育15分钟使样品变性。
    ③电泳
    上样前凝胶须预电泳5min，随后将样品加入上样孔。5–6V/cm电压下2h，电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2–3cm。
    ④紫外透射光下观察并拍照
    28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓（其大小决定于用于抽提RNA的物种类型），上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖体RNA）组成。在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染，将会在28S核糖体RNA带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带，RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。

    3样品cDNA合成
    ①反应体系
    序号    反应物    剂量
    1    逆转录buffer    2μl
    2    上游引物    0.2μl
    3    下游引物    0.2μl
    4    dNTP    0.1μl
    5    逆转录酶MMLV    0.5μl
    6    DEPC水    5μl
    7    RNA模版    2μl
    8    总体积    10μl
    轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
    ②混合液在加入逆转录酶MMLV
    之前先70℃干浴3分钟，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶0.5μl，37℃水浴60分钟。
    ③取出后立即95℃干浴3分钟，得到逆转录终溶液即为cDNA溶液，保存于-80℃待用。

    4梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因（β-actin）实时定量PCR
    ①β-actin阳性模板的标准梯度制备
    阳性模板的浓度为1011，反应前取3μl按10倍稀释（加水27μl并充分混匀）为1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104，以备用。
    ②反应体系如下：
    标准品反应体系
    序号    反应物    剂量
    1     SYBR Green 1 染料    10μl
    2    阳性模板上游引物F    0.5μl
    3    阳性模板下游引物R    0.5μl
    4    dNTP    0.5μl
    5    Taq酶    1μl
    6    阳性模板DNA    5μl
    7    ddH2O    32.5μl
    8    总体积    50μl
    轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
    管家基因反应体系：
    序号    反应物    剂量
  1    SYBR Green 1 染料    10μl
    2    内参照上游引物F    0.5μl
    3    内参照下游引物R    0.5μl
    4    dNTP    0.5μl
    5    Taq酶    1μl
    6    待测样品cDNA    5μl
    7    ddH2O    32.5μl
    8    总体积    50μl
    轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
    ③制备好的阳性标准品和检测样本同时上机，反应条件为：93℃ 2分钟，然后93℃ 1分钟，55℃ 2分钟，共40个循环。

    5 制备用于绘制梯度稀释标准曲线的DNA模板
    ①针对每一需要测量的基因，选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应。
    反应体系：
    序号    反应物    剂量
    1    10×PCR缓冲液    2.5 ul
    2    MgCl2溶液    1.5 ul
    3    上游引物F    0.5ul
    4    下游引物R    0.5ul
    5    dNTP混合液    3ul
    6    Taq聚合酶    1ul
    7    cDNA    1ul
    8    加水至总体积为    25ul
    轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
    35个PCR循环（94℃1分钟；55℃1分钟；72℃1分钟）； 72oC延伸5分钟。
    ②PCR产物与 DNA Ladder在2％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。
    ③将PCR产物进行10倍梯度稀释: 将PCR产物进行10倍梯度稀释:
    设定PCR产物浓度为1×1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104几个浓度梯度。

    6 待测样品的待测基因实时定量PCR
    ①所有cDNA样品分别配置实时定量 PCR反应体系。
    体系配置如下：序号    反应物    剂量
    1    SYBR Green 1 染料  10 ul
    2    上游引物    1ul
    3    下游引物    1ul
    4    dNTP   1ul
    5    Taq聚合酶    2ul
    6    待测样品cDNA    5ul
    7    ddH2O   30ul
    8    总体积    50ul
    轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
    ②将配制好的PCR反应溶液置于Realtime PCR仪上进行PCR扩增反应。反应条件为：93℃2分钟预变性，然后按93℃
    1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，共40做个循环，后72℃7分钟延伸。7 实时定量PCR使用引物列表
    引物设计软件：Primer Premier
    5.0，并遵循以下原则：引物与模板的序列紧密互补；引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构；引物不在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。