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技术支持

动物组织细胞基因组DNA提取 古朵实验√

发布时间:2020-07-27   点击次数:167次



一、实验原理

真核生物的一切有核细胞(包括培养细胞)都能用来制备基因组 DNA.真核生物的DNA是以染色体的形式存在于细胞核内,因此,制备DNA的原则是既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离,又要保持DNA分子的完整。提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含SDS(十二烷基硫酸钠)和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质,再用酚和氯-仿/异戊-醇抽提分离蛋白质,得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。

蛋白酶K的重要特性是能在SDS和EDTA(乙-二胺四乙酸二钠)存在下保持很高的活性。在匀浆后提取DNA的反应体系中,SDS可破坏细胞膜、核膜,并使组织蛋白与DNA分离,EDTA则抑制细胞中Dnase的 活性;而蛋白酶K可将蛋白质降解成小肽或氨基酸,使DNA分子完整地分离出来。

 

 



二、仪器及试剂

1. 仪器:

恒温水浴锅、台式离心机、紫外分光光度计(GeneQuant)、移液器、玻璃匀浆器、离心管(灭菌)、吸头(灭菌)

2. 试剂:

(1)细胞裂解缓冲液:

Tris (pH8.0) 100 mmol/L

EDTA (pH 8.0) 500 mmol/L

NaCL 20 mmol/L

SDS 10%

胰RNA酶 20ug/ml

(2) 蛋白酶K:称取20mg蛋白酶k溶于1ml灭菌的双蒸水中,-20℃备用。

(3)TE缓冲液(pH 8.0):高压灭菌,室温贮存。

(4)酚,氯-仿,异戊-醇(25:24:1)。

(5)异丙-醇、冷无水乙醇、70%乙醇、灭菌水。

三、操作步骤

1. 取新鲜或冰冻动物组织块0.1g(0.5cm3),尽量剪碎。置于玻璃匀浆器中,加入1ml的细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块,转入1.5ml 离心管中,加入蛋白酶K (500ug/ml)20μl,混匀。在65℃恒温水浴锅中水浴30min,也可转入37℃水浴12-24h,间歇振荡离心管数次。于台式离心机以12000 rpm离心5min,取上清液入另一离心管中。

2.加2倍体积异丙-醇,倒转混匀后,可以看见丝状物,用100μl 吸头挑出,凉干,用200μlTE 重新溶解。(可进行PCR反应等,需要进一步纯化的按下列步骤进行。)

3.加等量的酚,氯-仿,异戊-醇(25:24:1)、振荡混匀,离心12000 rpm,5min。

4.取上层溶液至另一管,加入等体积的氯-仿,异戊-醇(24:1),振荡混匀,离心12000 rpm,5min。

5. 取上层溶液至另一管,加入1/2体积的7.5mol/L乙酸氨加入2倍体积的无水乙醇,混匀后室温沉淀2min ,离心12000 rpm ,10min。

6.小心倒掉上清液,将离心管倒置于吸水纸上,将附于管壁的残余液滴除掉。

7.用1ml 70%乙醇洗涤沉淀物1次,离心12000 rpm,5min。

8.小心倒掉上清液,将离心管倒置于吸水纸上,将附于管壁的残余液滴除掉,室温干燥。

9.加200ul TE重新溶解沉淀物,然后置于4℃或-20℃保存备用。

10.吸取适量样品于GeneQuant上检测浓度和纯度。

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