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技术支持

远慕技术:细胞裂解提取蛋白的步骤

更新时间:2020-09-01   点击次数:4856次

    在实验过程中,我们常常需要证明实验组相对于对照组某些蛋白质是多了还是少了,那么我们就需要先把细胞或组织中的蛋白质提取出来进行测量,今天就给大家介绍一下细胞与组织蛋白质提取的基本知识和步骤。

    蛋白样品制备的原则:

    1.尽可能采用简单方法,以避免蛋白丢失;

    2.细胞和组织样品的制备应尽可能减少蛋白质的降解,低温和蛋白酶抑制剂可防止蛋白质的降解;

    3.样品裂解液应新鲜制备,并分装存于-80℃,勿反复冻融已制备好的样品;

    4.通过超速离心清除其余杂质。

    一般的理解方法分为温和的裂解方法和剧烈的蛋白裂解方法。

    温和的裂解方法

    用于组成比较简单的样品,或分析某一特定的细胞器。

    (1)渗透裂解:血细胞、组织培养细胞

    (2)冻融裂解:细菌、组织培养细胞;液氮冻融

    (3)去污剂裂解:用去污剂溶解细胞膜、裂解细胞,释放内容物;用于组织细胞

    (4)酶裂解细胞:植物、细菌和真菌等含有细胞壁的细胞

 

 

    剧烈的蛋白裂解方法

    常用于难于破碎的细胞,如固体组织内的细胞,或具有坚硬细胞壁的细胞,如酵母细胞。

    (1)超声波裂解法:细胞样品

    (2)弗氏压碎器:高压下迫使细胞穿过小孔径而产生剪切力,从而裂解细胞;常用于含有细胞壁的微生物、藻类

    (3)研磨法:常用于固体组织、微生物;冻存于液氮中,随后研磨成粉末

    (4)机械匀浆法:

    (5)玻璃珠匀浆法:利用剧烈振荡的玻璃珠打破细胞壁;用于细胞悬液或微生物

    那么蛋白提取的步骤来了:

    所需器材:低温高速离心机,匀浆搅拌器,超声仪,真空泵,细胞挂勺等。

    所需试剂:RIPA裂解液,蛋白酶抑制剂(PMSF),无菌PBS等。

    蛋白样品提取

    1、细胞蛋白的提取:

    1.根据实验需要取出需要提取的细胞培养板,置于冰上,用吸引器吸除上清液。PS:所有操作均应在在冰上进行。

    2.每孔细胞(六孔板)中加入 1-2ml 4℃预冷的PBS溶液。平放轻轻摇动十秒钟清洗细胞,然后吸除洗液,共清洗洗细胞三次(目的是去除剩余的上清液),后一次不吸除上清液。

    3. 用刮勺将细胞轻轻刮下,接着用移液器将细胞和上清液转移至1.5ml离心管中,置入4度离心机(提前开离心机预冷),离心1.5min,弃去上清液。

    4.配置裂解液(所用裂解液为RIPA裂解液,可以使蛋白得到充分释放),每 1ml 裂解液加 10 μl PMSF(100mM),摇匀置于冰上。(PMSF 要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合)。PS:PMSF属于蛋白酶抑制剂,可以减少蛋白质的讲解,另外的蛋白酶抑制剂还可以用cocktail,NaF,NaN3等,也可以同时加入多种蛋白酶抑制剂。

    5.将配置好的裂解液加入第3步获得的细胞沉淀中,一般5*10^6个细胞加入100ul的裂解液,然后吹打重悬,使细胞充分裂解。

    6.用超声仪进一步裂解细胞:将细胞放置于冰上进行超声,一般功率选择为15%左右,裂解时间为1分钟(超声2s,休息4s),当超声一次后,离心管仍比较浑浊,可以间隔几分钟再次超声。

    7.超声结束后,将细胞于4度离心机,12000rpm离心 25min。

    8.将离心后的上清分装转移至1.5ml 离心管,保存于-80℃备用。

    2、组织中总蛋白的提取:

    1.将少量组织块置于 1.5ml离心管中,加入500ul含PMSF的强RIPA裂解液,先用干净的剪刀将组织块尽量剪碎,当组织较软时(如脑组织),接着用1ml枪头不断地吹打吸取,然后用匀浆器进一步打碎组织,后用超声仪进行超声裂解;当组织较韧时(如肌肉组织),可以直接用匀浆器打碎组织,后用超声仪进行超声裂解。(裂解组织就是通过不同的方法让组织块不断变小)。

    2.同上方法,将离心管置入 4度离心机,12000rpm离心25min,取上清分装于1.5ml离心管中并置于-80℃保存。

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