超纯质粒制备操作细则 远慕生物√

1溶液配制:

1.1 Buffer P1:(悬浮用)

  成分：50mM Tris.HCl, pH8.0, 10mM EDTA, 100ug/mL Rnase A

  配制：

  2M Tris.HCl, pH 8.0  25mL

  0.5M EDTA, pH 8.0  20mL

双蒸水至 1L，灭菌。

使用前每1L buffer加入100mg RNAse A，并于4℃保存。

1.2 Buffer P2：（裂解用）

  成分：200mM NaOH, 1% SDS

  配制：

  8g NaOH固体溶解于500mL双蒸水中，成0.4M NaOH溶液

  10g SDS溶于500mL双蒸水中，成2% SDS溶液

  使用前将上述两种溶液等体积混合后使用

  注意：

    Buffer P2混合后不宜放置时间过场，每次配够一周使用的即可。长时间放置容易产生沉淀。若有沉淀产生，在37℃保温一段时间使沉淀溶解。

1.3 Buffer P3：（中和用）

  成分：3M KAc（醋酸钾），pH4.8

  配制：将147g KAc 溶于350mL双蒸水中，用约60mL冰醋酸调节PH值，然后继续用浓盐酸调节pH值至约5左右.蕞后定容至500mL。

1.4 Buffer QBT:(平衡用)

成分：750mL NaCl; 50mM MOPS.Ph7.0;15% 异丙醇，0.15% Triton X-100

配制：溶解43.83g NaCl, 10.46g MOPS到800 mL 双蒸水中，调节pH值至7.0，然后加入150mL 异丙醇和15Ml Triton X-100,加水定容至1L。

1.5 Buffer QC：（洗涤用）

成分：1.0 M NaCl，50Mm MOPS, Ph7.0

配制：溶解58.44g NaCl, 10.46 MOPS至800 mL 双蒸水中，调节pH值至7.0,然后加入150mL异丙醇，定容至1L。

2 Qiagen-tip 20质粒小量提取操作步骤

2.1 取过夜培养的菌液2mL，12000rpm离心30秒至1分钟，去净上清。

2.2用0.3mL Buffer P1重新充分悬浮沉淀。

2.3加入0.3mL Buffer P2，轻轻颠倒摇匀，室温下放置5分钟。

注意：此步不应剧烈振荡，否则容易在所提质粒中混入基因组DNA。

2.4 Buffer P2使用后应盖紧盖子，否则NaOH易与空气中的CO2起反应。

2.5 加入0.3mL Buffer P3，轻轻混匀，于4℃冰箱中放置10分钟。

12000rpm高速离心15分钟。

2.6 用1mL Buffer QBT平衡Qiagen-tip 20柱，并让QBT慢慢流下。

2.7 将步骤5所得的上清倒入已平衡好的Qiagen-tip 20柱，让其慢慢流下。

2.8 每次用1mL QC清洗Qiagen-tip 20柱，清洗3次。

2.9用0.8mL QF洗脱DNA。

2.10 用0.6倍体积（500uL）的异丙醇沉淀质粒，颠倒混匀，室温放置5分钟,12000rpm高速离心15分钟。

2.11去上清，用1mL 70%乙醇洗涤沉淀，12000rpm高速离心3分钟，去净上清。

2.12重复步骤11一次。

注意：洗涤时，每次用吸水纸吸一下，尽量去净残余的液体。

去净上清很重要，否则除不净多余的盐分，将严重影响的后面的测序反应。

2.13 抽干多余的乙醇，用30～50uL双蒸水溶解DNA,取2uL电泳检测定量，用于测序。

3 Qiagen-tip 20柱子的清洗处理

3.1用5mL缓冲液清洗柱子，洗去多余的DNA及其他杂质，备用。

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