液体培养液中裂解感染实验

实验材料： λgtll 重组噬菌体大肠杆菌  hsdR 菌株
试剂、试剂盒 细胞裂解液IPTGMgS04?7 H20苯甲基磺xian氯SMLB 培养液

实验步骤：
材料
缓冲液剂及溶液
贮存液，缓冲液及试剂的组分见附录 1。
将贮存液稀释至合适浓度。
细胞裂解液（每个分析的噬斑需 100ul)
50 mmol/L Tris-Cl (pH6.8)
100 mmol/L 二硫苏糖酵
2%(m/V)SDS
0.1%(m/V) 溴酚蓝
10%(V/V) 甘油
IPTG(1mol/L)(每个分析的噬斑需 70ul)
MgS04?7 H20(1mol/L)
苯甲基磺xian氯（PMSF)(100 mmol/L)
SM 用完后弃掉以防污染。
凝胶 SDS-聚丙烯-酰胺凝胶

请见步骤 12。
培养液：含 50ug/ml 氨苄青霉素的 LB 培养液
离心机及转子：SorvallSS-34 转子或同等产品
专用设备
沸水水浴
液氮
载体及细菌菌株
λgtll 重组噬菌体
制备λ重组噬菌体贮存液：单个噬斑放入约 1mlSM 中室温放置 2 h 成通过制备平板裂解液来制备
大肠杆菌 hsdR 菌株

方法
1. 取大肠杆菌  hsdR 菌株单个菌落接种到 50 ml 含 50ug/ml 氨苄青霉素的 LB 培养液中，37°C 过夜培养，并不断温和振荡（摇床 250r/min)。
2. 将培养液转移至离心管中，室温下 4000 g 离心10min。
3. 弃上清，用 25 ml10mmol/LMgS04 重悬细胞，使用前将细菌悬液置于冰上保存。
4. 在 15 ml 无菌管中，将 8 ml 含 50ug/ml 氨苄青霉素的 LB，400ul 细菌悬液及 100ul 噬菌体裂解液混合。
因为融合蛋白质是从感染细胞本身分离的而非裂解液, 因此有必要获得目的λ噬菌体的高产量感染同时避免培养物的过早溶菌现象。由此. 在操作过程中，常使用低感染复数（毎 16000 细胞约 1 pfu)。
5. 将管放于 37°C 水浴中振荡 2 h。
6. 每份培养物取 lml 到无菌微量离心管中，盖紧管盖，存于液氮中。向剩余感染的培养物中加 70ul 1mol/LIPTG,37°C 继续培养。
7. 每隔 1 h, 每份感染的细胞培养物取 1 ml 转到微离心管中，盖紧管盖，存于液氮中。通过此方式，收集 4 h 内的小份培养液。
8. 剩余的感染培养物 37°C 继续温育 12 h, 从每份培养物中蕞后一次取 lml 样品，盖紧管盖，液氮中放 30 min。
9. 融化所有样品，于室温最大速度离心 1 min, 收集感染的细菌，去掉细菌培养液。
10. 每管中加 100ul 裂解缓冲液，强烈涡旋迅速重悬细胞。
11. 将样品放入沸水中 3 min, 转到室温加 1ul 100 mmol/LPMSF, 振荡混匀。
12. 用 SDS 聚丙烯-酰胺凝胶电泳与免疫印迹直接分析样品。电泳前，样品在微离心机中最大转速 1 min, 取 25 上清液加到 SDS-聚丙烯凝胶上或放到-70°C 保存直至使用。
用 IPTG 处理培养物后目的融合蛋白的量在 1~4 h 内是逐步增高的。此后，蛋白质的量虽可能增加，可能保持不变，也可能因感染的细胞裂解释放蛋白质到培养物中而降低。