培养基的制备、使用常见问题解答

一、培养基的制备
正确制备培养基时微生物检验的最基础步骤之一。使用脱水培养基和其他成分，尤其是含有有毒物质(如胆盐或其他选择剂)的成分时,应遵守良好实验室规范和生产厂商提供的使用说明。培养基的不正确制备会导致培养基出现质量问题。
使用商品化脱水合成培养基制备培养基时，应严格按照厂商提供的使用说明配置。记录所有相关数据，如质量/体积、pH、制备日期、灭菌条件和制备人员等。
使用各别成分制备培养基时,应按照配方准确配制,记录所有细节信息,如；培养基名称和类型及试剂级别、每个成分物质含量、制造商、批号、pH、培养基体积(分装体积)、无菌措施(包括实施的方式、温度及时间)、配置日期、人员等,以便潮源。

1.水
除特定要求,实验室用水的电导率在25℃下应不高于25uS/cm(相当于电阻率≥0.4MΩcm)。
微生物污染应不超过103CFU/mL，最好低于102CFU/mL。应根GB/T 5750.12或其他有效方法,定期检验微生物的污染。

2.称量和复水
称量所需量的脱水培养基(注意防止吸入粉末，尤其是含有有害物质的培养基粉末),先加入少量水,充分混合(注意避免培养基结块)后再加水至所需的量。

3.溶解和分装
脱水培养基加水后适当加热,并不搅拌使其快速溶解，必要时，重新溶解。含琼脂的培养基在加热溶解前应浸泡几分钟。

4.pH的测定和调整
用pH计测定pH,必要时在灭菌前调节pH，除特殊说明外,培养基灭菌后冷却至25℃时,要求pH的变化不超过0.2pH单位.通常使用浓度约为40g/L(约1mol/L)的氢氧hua钠溶液或浓度约为36.5g/L（约1mol/L)的盐酸溶液调节pH。如果灭菌后调节pH，溶液需灭菌。
注:商品化培养基在高压灭菌前后pH可能发生明显变化,但使用蒸馏水或去离子水时,灭菌前无需调节pH。

5.分装
将配置好的培养基分装到适当的容器中，容器的体积至少为体积的1.2倍。

6.灭菌
①概述
培养基和试剂的灭菌通常采用湿热灭菌或过滤灭菌。
有些培养基无需高压灭菌,可煮灭菌。如，含亮绿的肠道菌培养基对光和热特别敏感，应在煮沸后快速冷却，避光保存。同样，一些试剂则不需要灭菌，直接使用(参见相关标准或生产厂商的使用说明）。
②湿热灭菌
湿热灭菌在高压锅或培养基制备器中进行。高压霉菌一般采用121℃±3℃霉菌15min。如果培养基的体积超过1000mL，要对灭菌条件进行适当的调整。所有操作均要按照标准和使用说明的规定进行。
注：大容量培养基（＞1000mL）灭菌时可能会造成过度加热。
加热后应采取适当的方式冷却，防止沸溢。这对大容量培养基和敏感性培养基（如含亮绿的培养基）是非常重要的。

③过滤灭菌
过滤灭菌可以在真空负压或正压条件下进行。使用无菌设备和0.2um孔径的滤膜。将过滤装置的各个部分消毒灭菌,或使用预消毒设备。
一些滤膜上附着蛋白质或其他物质(如抗生素)。为达到有效过滤,应事先将滤膜用无菌水润湿。

④监测
应对经湿热或过滤灭菌的培养基进行监测,尤其要对pH、色泽、灭菌效果和均匀度等指标进行监测。

7.添加剂的制备
制备含有有毒物质(特别是抗生素）时应小心操作，避免因粉末的扩散造成实验人员过敏或发生其他不良反应。采用适当的预防措施并小心按照产品使用说明操作。不要使用过期的试剂；抗生素工作溶液现配现用；批量配置的抗生素溶液分装后向冷冻保存，但解冻后的贮存溶液不可再次冷冻；厂商应提供冷冻对抗生素活性影响的相关资料，也可由使用者自行测定。

二、培养基配置中常见的问题
1.培养基的pH什么时候测？用什么测？怎么测？
答：对于培养基应该灭菌前测定和调整，灭菌后在测定，如果范围超出正负0.2则培养基品质不良。

2.灭菌后的培养基是否都要测pH值？如何测定pH值？
答：每个制备批次的培养基都应测定pH，可采用pH试纸或pH计测量。

3.稀释液灭菌后pH值是否有变化？有何影响？（如pH7.0氯hua钠-蛋白胨缓冲液，pH6.8无菌磷酸盐缓冲液）
答：一般pH有下降现象，约0.2左右，不同培养基pH变化可能不同。

4. 孟加拉培养基是否可以取代玫瑰红钠琼脂进行培养霉菌和酵母菌？
答：根据中国药典，采用玫瑰红钠琼脂。

5. 配制PH值7.0氯hua钠-蛋白胨缓冲液时有时因为高压灭菌器灭菌过程温度过高而导致培养基混浊了，这种情况缓冲液还能用吗？
答：建议按正常温度灭菌，混浊培养基建议不要使用。

6.含琼脂培养基在冷藏中形成冰晶怎么处理？销毁还是加热再用？
答：建议不要使用。

7.融化的培养基为什么不能再冷水中冷却？
答：防止受热不均引起结块。

8.灭菌后，灭菌锅需自然冷却降压才可以打开，这段时间是否会造成过度灭菌。
答：自然冷却过程已经计算在正常灭菌时间内了，不会造成过度灭菌。

9.培养基所用器具若使用湿热灭菌，是否必须待干燥后才可以使用？若烘干或其它方法，中间过程怎样防止微生物污染？
答：如果是马上使用且不是用于非水溶性供试液的制备及实验，不一定要烘干；否则，应干燥后使用，灭菌及干燥尽量在同一锅里进行，或用纱布和牛皮纸包扎紧密。

10.培养基的避光储存，是否配置好的培养基其全部放避光储存？
答：最好都避光保存。无条件时，光敏感的培养基一定要。

11.商品培养基干粉说是加蒸馏水溶解，实际操作是否可以用纯化水或注射用水？
答：只要不含有任何可能抑制或影响微生物生长的物质的水均可。

12.培养基及器具灭菌可否同一设备同灭菌时间进行灭菌？
答：最好分开灭菌，条件不允许时可同炉灭菌，前提是都是洁净无污染的。

13.培养基的保温能否用60℃的培养箱，它与45℃—55℃水浴锅保温方法有何不同？
答：可以用恒温培养箱保温，但保温温度一般是50℃左右，且时间不能过长，一般是不超过4小时。

14.培养基的贮存是否需要放置于2—10℃冰箱内？
答：需冷藏保存的培养基外包装上会写明。

15.培养基灭菌后成份会有所蒸发减少，如何处理这个问题？
答：正常情况下蒸发量较少，可忽略不计。

16.培养基融化后出现浑浊是有哪些方面的原因引起的？应如何避免？
答：可能的情况有
1.培养基配置用水不符合规定；
2.灭菌过程温度升温慢或降温慢；
3.培养基储存不当；
4.融化时沸腾时间较长等。

17.准备好的培养基有效期如何验证？
答：定期取出培养基验证其无菌性，促生长能力等方面。

18.培养基配制好灭菌后，在高压容器中保温降至50℃左右，可不可行？
答：建议最好不要，避免过度受热。

19.脱水培养基对湿度是否有要求？多少适宜？
答：按要求室温干燥环境储存即可。

20.培养基pH值测定温度在25℃，这个温度应怎么控制？比如固体培养基，固体培养基使用过程中还能调节pH值吗？
答：可水浴控制培养基温度。

21.配制培养基过程中，按说明书称定量，加规定的纯化水，煮沸溶解，为了避免煮沸过程总减少水分，是否要在配制过程适当增加水?比如陪硫乙醇酸盐流体培养基。
答：可适量增加，自己掌握。

22.商品培养基一定要当天配当天用吗？可否在一周内用完？
答：不是即配即用的培养基的话，储存得当，可以使用。

23.称量培养基时，注意不要吸入粉末，这粉末是指何物？
答：就是你所称量的干粉培养基 ，因为培养基的粉末对呼吸道有刺激作用，而且培养基中的某些成分，如亚shai酸盐、叠氮hua钠、乙酰胺等，长期吸入并在体内累积到一定量会对人体健康有危害。所以培养基配制称量需做好个人防护，且最好选择少粉尘环保型颗粒培养基。

24.煮培养基，用不锈钢锅在电磁炉上煮可行？硫乙醇培养基是否要煮沸？如何煮沸？用不锈钢锅在电磁炉上煮沸可行吗？可不可以水浴煮沸呢？
答：硫乙醇应煮沸，量大时，我实验室用不锈钢锅在电磁炉上煮沸。不建议水浴煮沸，因为水浴煮沸琼脂粉很难溶，导致琼脂分装不均匀，前段分装的琼脂含量少，后段分装的琼脂含量高，导致有的管或瓶中的凝固。

25.如培养基在高压灭菌器中温度需自然下降20度才开盖吗？
答：高温灭菌器有安全阀，温度下降到安全阀可打开时将培养基取出室温冷却，各型号灭菌器安全开盖温度不尽相同。