大鼠原代细胞分离与培养实验分析

　　一、大鼠神经元细胞（酶消化法）

　　简述：新生24h或E18胎鼠，取脑，剥离海马，剪碎，木瓜酶消化，清洗过筛后铺于多聚赖氨酸包被的培养板中。

　　二、大鼠雪旺细胞（植块法）

　　简述：新生24h大鼠，取坐骨神经，剥去外膜和束膜，剪成1mm3的小块，均匀铺于培养皿内，加少量血清，37℃ CO2培养2h后，再加入培养基，24-48h后有细胞爬出。

　　三、大鼠胰岛（酶消化加密度梯度离心）

　　简述：SD大鼠，常规麻醉、固定、消毒、进腹、胆总管插管，逆行注入预冷的１mg/ml胶原酶P溶液10ml。迅速取下胰腺，38℃水浴消化10分钟，600μm不锈钢网过滤，加入4℃新生牛血清和4℃Hank’s液终止消化。细胞悬液离心后，4℃ Hank’s液洗涤两次。沉淀物加25%Ficoll混匀，其上依次分别加入23%、20%、11%Ficoll溶液和Hank’s液，离心后吸出23%-20% 及20%-11%界面的胰岛，用4℃Hank’s液洗涤离心共三次。

　　四、大鼠心脏窦房结细胞（酶消化法）

　　简述：大鼠心脏窦房结位于上腔静脉靠近右心房处的内壁上；取出生2-3day的新生大鼠，75%酒精浸泡后，固定于解剖板上，开胸，显微剪分离出上腔静脉及右心房一部，至于冷的HANKS缓冲液中，于解剖镜下观察搏动点，并剪去多余部分；之后将几只鼠的窦房结集中，剪碎后用0.5mg/ml II型胶原酶37℃消化20-30分钟，期间吹打数次，可分部收集消化下来的细胞。收集到的细胞加入10倍体积的PBS，1000rpm离心5分钟，弃上清，重复清洗一遍，沉淀中加入15%FBS的高糖DMEM培养基，重悬细胞，铺板，37℃，5%CO2 培养90分钟后，将未贴壁的细胞转移至新的培养皿中，继续培养，每天换液一次。

　　五、大鼠关节滑膜间质细胞（酶消化法）

　　简述：大鼠麻醉后，75%酒精消毒术区，于双侧膝关节关节腔取出滑膜组织，浸泡于含1%链霉素和青霉素的双抗H-DMEM中，低温下转移至超净工作台。使用含1 %双抗的PBS冲洗滑膜组织3次，用眼科剪将其剪成约1 mm×1 mm大小的组织块。加入10倍体积的0.4% Ⅰ型胶原酶，于37 ℃，体积分数5%CO2饱和湿度条件下进行4 h消化，待絮状物大部分消失后，100μm细胞筛过滤，吸取滤过液，1 200 r/min离心5 min，弃上清液，无菌PBS洗涤3次，用含体积分数10%胎牛血清的H-DMEM高糖培养基(含200 mmol/L谷氨酰胺，100 μmol/L抗坏血酸，100 U/mL青霉素，100 mg/L链霉素)，以2×106/孔的细胞浓度接种于六孔板中，置37 ℃，体积分数5%CO2培养箱中培养。