植物组织培养苗的污染与检测

一、在组织培养中污染来源
1. 植物本身具有：
（1）植物病原菌
有些作物的病害已被透彻研究，因此在大量繁殖时，可立即检查出来，但有些则否，造成若有污染时，不知来源为何。

（2）和植物有关的菌类
有修植物本身便会和一些菌种共生，或是寄生于植物内部。
 
2. 植物所带入的污染：内在污染源
许多植物表面或大气中生存的微生物，可经由植物自然的开口或伤口进如植物内部，而有一些兼性腐生菌或绝对寄生菌，可藉由载体或是拥有一些侵入的机制侵入植物内部，依其存在的地方分为

1. 细胞内－inter
2. 细胞间隙－interacellular
种类有：virus/bin毒、viroids类病毒、prokarytoes原核生物、fungi真菌、柔膜纲（ex:mite）、立克次体。

3. 操作室：外在污染源
在组织大量培养下，除了植物本身外，大部分最有可能的污染来源便是来自操作室。依其可能原因分析为：

（1）空气
在操作室中，未过滤空气带有大量的微生物，随者操作人员或植株接触时，而污染培养皿。故在国外对于操作室内空气的清洁度分为四种等级：
ClassⅠ.没有容易培养的微生物，和作物之主要病原菌
Ⅱ.没有容易培养的微生物，和作物特殊病原菌
Ⅲ.没有容易培养的微生物
Ⅳ.未做检测

（2）不*的灭菌设备或技术
因为使用灭菌不*的设备或是技术，而导致植株或培养皿的污染，例如：有些酵母菌，可避免酒精消毒，还有一些会产生内孢子，而避免火焰消毒。

（3）人员
在整个操作室内，人员可说是最大的带菌者，其不管在毛发或是衣服等，都隐藏属不清的菌。在进入操作室前，最好能将作业人员清洁处理，然后换上脱鞋，或是将尘土去掉。

（4）细缝的存在
因为若操作室有细缝的存在，则造成外果气体直接流入，使得空气中菌数增加。

（5）操作台上的滤网不干净
因为使用过久，或不当保养，而造成滤网坏掉，而产生更多的污染。

（6）蹒及蓟马的存在
此为珠形网，具有活动能力，能到处跑来跑去。因此常造成散乱的污染。

4.栽培过程污染
在栽培室，组培瓶外和外界气体交换时，亦会有污染进入。污染机率取决于空气中带菌密度与组培瓶空气交换率。

二、污染的种类及形式
1. 污染的形成
依据污染的来源，可将污染分为三个形式：
a.由植物内部或病原菌所造成的污染
植物内部或病原菌所造成的污染，所呈现是系统性，及从stageo~stage4中都可发现，而且占有一定的百分比。
b. 在制造时所造成的污染
如因蹒或是空气中的关系造成的污染，其所表现的方式是散乱（random）性非系统性，且不集中于某一地方，占的百分比也不一定，是机率性。
c. 技术上的失误
其呈现方式有一定性，例如由此工作台所生产得植株都被污染，表现为带状性，可用卷标方式来追踪，以进而改善。

2. 污染的来源分类
A、污染的种类，以总体来说可分为下列几种：
a.病毒(virus)－常存在植物内部。
b.(viroids)常存在植物内部
c.细菌－在组织培养中又分依其来源和所在地方分类如下：
(a)phlem-eimited生长于韧皮部 xylem-eimited生长于木质部
(b)植物病原细菌
(c)空气中存在的细菌，但因植物有伤口，或是营养丰富的地方，可分为植物表面的细菌或植物内部的细菌。
例如：Bacillus spp.可抗热，在不*灭菌的玻璃器皿中可发现。
(d)菌质体
是一种像细菌的微生物，但是本身没有细胞壁，可以在培养基培养，亦可用特殊的抗生素（四环霉素）抑制其生长。其种类有microplasm与spiroplasm。
(e)真菌
在植物病害中，真菌所引起的病害特别多且严重，且因其会产生孢子，所以会随着空气飘散。一旦落于适当的环境下，一粒小小的孢子便会扩大成一个菌落，污染整个组织培养瓶。例如常见的酵母菌，其菌落为粉红色，若有其出现，则其污染来源可能来自空气。
(f)蹒或蓟马
此为细小的微生物，具有活动能力，喜欢吃菌丝。在国内使用期限较久的组培场中常出现此问题。
(g)立克次体
目前未清楚其污染方式。

B、以培养难易区分污染源
1. 在培养基中易培养菌类
细菌，真菌，蹒。
2. 在培养基中不易培养的菌类
病毒，类病毒，立克次体，菌质体。
在组织培养过程中，常造成污染或是造成威胁的菌类，称为培养菌类。因常为腐生菌，且营养需求不高（随便吃，随便活）所以常造成成本的增加。而且污染后，常使培养基的pH值降低，洋菜无法凝结，而使植物无法生长或是产生有毒物质或副产品，使得植物生长缓慢，或是干脆就在植物上生长。在培养基上不易培养或是不能培养的菌种，就不会造成太大的威胁。

C、各种菌种其主要传播方式
1. 病毒，类病毒，菌质体－常利用机械或利用有载体传播。
2. 细菌－可经人力，气流或水，及昆虫等传播。
3. 真菌－亦同上，但孢子可经空气传播。
4. 蓟马－同上，具活动力，自由运动，应慎防出现。

D、依其菌落生长出现的快慢区别
1. 可见的菌落在组织培养中。一些易培养的菌类，其生长特性为快速蔓延整个组培瓶。但此种污染可利用工作人员之视觉观察将之侦测出来将之销毁，对后代植株造成威胁不大。
2. 潜藏的菌落－在组织培养中有些不易培养或是在植物内部寄生或共生的菌类或病原菌，在培养时没有表现出来，但是有存在或只有很微弱的表现，但是未被察觉出来。于是便造成了对后代植株的重大威胁及成本的增加。

三、污染种类的鉴定方式
1. 针对培养难易菌种鉴定方式
A、针对易培养的菌种：其种类为真菌，细菌
a.就真菌而言，主要是利用显微镜，视其孢子形态、产孢结构、及菌丝有无隔膜、还有细胞壁之形成加以鉴定。目前亦有使用DNA探针加以分析。
b.就细菌而言，则是利用其特殊的生化反应，或是利用选择性的培养基。目前亦有如用fatty acid profiling技术和商业化的test kits加以鉴定。

B、不易培养的菌种，如菌质体，病毒，类病毒。
a.就菌质体而言，主要是观察其在培养基上菌落的形态。
b.病毒而言，分析其核酸的组成与例子的外形。
类病毒因没有套膜，以上两种常利用其DNA有同源性而做探针侦测。

C、病原菌的侦测
利用柯霍氏法来测其病源性。而利用分子诊断，如血清、ELISA、DNA序列、核酸的探针以鉴定种类。

2. 鉴定菌种常用的方式与应用的微生物种类
方法                     目标微生物
无种别性
指示培养               所有可培养的细菌
DNA/RNA 萤光染色法         菌质体及有关原核生物
Leaf dip electon microscopy        长条状的病毒，其数目较多者亦适用
电泳                 类病毒
有种别性
ELISA                 细菌及病毒
PALIAS                细菌及病毒
ISEM                  病毒
DNA探针                所有微生物
快速诊断的 kits             细菌
Fatty acid profiling            细菌

3. 一般对细菌的基本测试
a.Gram stain
b.形状
c.游动性
d.催化酵素的测试
e.氧化酵素的测试
f.热稳定性
g.行氧化作用或发酵作用

四、针对污染源常使用的防治方法
A. 种类
1. 热疗－对病毒较有效但须花费时间。处理时，需6-12星期在30-40℃。
2. 冷疗法－亦对病毒有效。
3. 利用抗生素。
4. 以分生组织，不带病毒等污染源。
5. 利用培养基中高糖，高盐的浓度。
6. 利用抗并du药物。
7. 营养需求不同。
8. 利用水。
9. 抽样检测。

B、防治方法之效果讨论
1. 热疗法及冷疗法
对病毒有效，但须花时间处理，例如：热疗法处理时间需花6-12星期在30-40℃。

2. 利用抗生素
这是目前较常用的方法，但是在抗生素加入培养基，其有效浓度常因植物具有半渗透功能，而使浓度无法达到有效浓度。使用抗生素时，需注意下列事项：
（1）要知道抑制的微生物为何，再使用抗生素，及对症下药。
（2）要决定最小抑制浓度，以降低成本。
（3）要确定抗生素不会对植物造成并害或突变。
（4）确定抗生素在培养基上是否有作用。
（5）使用时，常因需要而多种混合或交替使用。
（6）有些抗生素在某些国家是禁止使用，使用前必须做询问此药剂是否合法使用。

使用抗生素的缺点
（1）可能对哺乳类动物有害。
（2）若是使用生长期较长的植物，微生物亦有抗药性产生。
（3）容易错误使用：没有针对微生物而使用各种不同的抗生素。