你还搞不清楚病毒载体的用法？

基因表达载体是广大科研人员普遍需要的研究工具，而病毒载体凭借其优良效能则越来越成为最shou欢迎、也最为普遍的基因表达载体。然而病毒载体也分为好几类，不同实验类型、不同研究目的、不同“受体"性质需要我们准确评估与选择。因此，详细了解不同病毒载体的相关知识是我们科研人员必须掌握的。本文详细介绍了常见病毒载体的原理、特点和适用范围。

一、慢病毒载体慢病毒（Lentivirus）属于逆转录病毒的一种，有由于其感染潜伏期较长，临床症状发展缓慢，被称为慢病毒。而慢病毒载体则是在慢病毒的基础上改变重组其构成原件，进而在去除其生物危害性的同时，利用其高感染等性能表达目的基因。人类免疫缺陷病毒（HIV）是常见的慢病毒载体改造原型。如下以HIV中最为常见的HIV-1型：

HIV-1为双链RNA病毒，主要组分包含三种重要病毒核心基因：gag（编码结构蛋白或称为核心蛋白），pop（编码复制相关酶类），env（编码包膜糖蛋白）；调节基因：tat（转录控制）和rev（表达调节）；四个辅助基因：vif、vpr、vpu、nef（作为毒力因子参与宿主细胞的识别和感染）；两端为长末端重复序列LTR (内含复制所需的顺式作用元件)。

第一代慢病毒载体为双质粒系统，基本保留了HIV的所有组件，产毒滴度低，复制缺陷，且存在产生复制能力的活性HIV病毒的可能；第二代慢病毒载体为三质粒系统，分为包装质粒、包膜质粒和载体质粒，其中使用水泡性口炎病毒糖蛋白（VSV-G）基因替代env基因，拓宽了病毒的感染宿主细胞范围，虽然三质粒降低了病毒重组的可能，但是由于其依然保留HIV大部分附属基因，产生活性HIV依然存在可能；第三代慢病毒载体则去除了HIV病毒所有辅助序列，只保留核心的3个基yin（gag、pol、rev），病毒RNA不能转录，故意外重组的可能性很低；第四代慢病毒载体为四质粒系统，即将病毒核心基因分散在多个质粒中(pGag/Pol、pRev、pVSV-G和载体质粒)，同时去除tat，故病毒重组、产生活性病毒的可能进一步降低，同时四质粒系统中的载体质粒中可以包含可诱导基因，使得该基因表达系统可以条件性调控。

慢病毒载体感染能力强、且宿主广泛（分裂和非分裂细胞）；能够整合进宿主DNA且筛选后稳定遗传；表达潜伏期短，一般细胞24h-48h、体内96小时可表达；慢病毒载体可以插入组织特异性启动子或增强子；慢病毒携带基因的长度大致无5kb以内。由于慢病毒依然是HIV来源，自然宿主是人，依然存在潜在的生物毒性，故操作时避免直接接触人体。慢病毒载体适合常见类型的体外研究（细胞），包括过表达、敲除、敲低都基因干预操作，但慢病毒载体不适合于体内研究，因为其滴度不能够满足体内用量且免疫原性较强。

二、腺病毒载体腺病毒（Adenovirus）是一种线性无包膜的双链DNA病毒，腺病毒的衣壳结构可以分为五邻体和六邻体两部分，腺病毒的基因组主要包括病毒DNA复制前期的Ela、Elb、E2a、E2b、E3、E4（编码病毒调节蛋白）和DNA复制后期的Ll～L5（编码病毒结构蛋白），以及两端的反向重复序列，ITRs（包装所必需的顺式作用元件）。

在天然腺病毒（主要是人5型腺病毒）的基础上改造而得的腺病毒载体，其基因携带量增加，感染效率增加，且生物毒性降低。第一代腺病毒载体是删除Ela、Elb基因的复制缺陷病毒，其复制必须在表达E1蛋白的细胞中，病毒滴度高且稳定，不整合宿主基因组，但包装量少（约为4.5kb），免疫原性强；第二代腺病毒载体进一步删减病毒原有基因，在减少免疫原性和细胞毒性的同时，进一步提高载体容量，可以达到14kb，但是病毒滴度较低；第三代腺病毒载体则只保留了ITRs和包装信号序列，因此其携带外源基因容量更大，约36 kb，但由于病毒包装基因必须基因被删除，第三代腺病毒载体工作组装需要辅助病毒（表达腺病毒装配必须基因），第三代腺病毒载体容量大，免疫原性低，但是量产困难，存在辅助病毒污染风险。

腺病毒感染力强、宿主范围广（分裂和非分裂细胞），表达迅速（24h-48h）且表达量高，包装容量大，但腺病毒不能整合入宿主基因组内，规避了整合入宿主基因组的生物风险，安全的同时也形成了细胞分裂过程中不能均等分配给子细胞。腺病毒载体适合一般体外实验，使用细胞类型较多，免疫原性较强，不适合体内实验。

三、腺相关病毒腺相关病毒（Adeno-associated virus，AAV）是无包膜单链线状DNA 缺陷型病毒，外包二十面体衣壳蛋白，基因组包括两端的反向重复序列ITR（包含复制和包装所需的唯1顺式作用元件），中间的两个核心基因：Rep 基因（编码参与病毒复制、包装和基因整合的蛋白），Cap（编码结构蛋白VP1、VP2、VP3）。AAV为复制缺陷病毒，不能独立存在，其复制增殖需要辅助病毒作用。衣壳蛋白不同的AAV病毒，对组织器官的亲和力不同，形成各种AAV血清型：如AAV1较易感染骨骼肌，AAV6较易感染肺部，AAV8则亲嗜肝脏，AAV9则为神经和外周组织（见后表）。

腺相关病毒载体（重组腺相关病毒载体, rAAV）的发展同样在天然AAV的基础上不断优化改进。最早采用重组载体质粒、目的基因质粒、辅助质粒、腺病毒共转染细胞，步骤多、产率低、风险高；随后采用目的基因载体、AAV基因载体(rep／cap)、辅助质粒（包含E1a、E1b、E2a、E4、VA等能完成腺病毒相似辅助功能的基因元件）共转染细胞，但包装效率低，生物风险高；Ad/AAV嵌合载体、辅助质粒感染恒定表达Rep/Cap细胞系的方法以及AAV生产细胞系法，这些方法均操作繁琐；目前最chang用的载体方法为Bac-to-Bac杆状病毒表达系统：将rAAV包装组分AAV2的Rep基因序列、Cap基因序列、以及ITR-目的基因表达框的序列分别构建到三个杆状病毒中，分别转染昆虫细胞Sf9各自扩增，然后通过共感染Sf9细胞来生产rAAV，该方法可以量产、成本低、操作简单且不会对人体产生损伤。

AAV载体免疫原性极低，非常适合动物实验，感染效率高，宿主范围广（分裂和不分裂细胞），不整合到基因组，稳定表达持续时间长（半年以上），但是表达水平低且慢（细胞需要1周，动物需要2周），携带目的基因片段约为2kb。