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技术支持

生物大分子的色谱纯化方法

发布时间:2022-05-10   点击次数:100次

 

 一、生物大分子色谱纯化方法的选择思路
通常在做纯化前对自己的目标物质特性了解越多对纯化将会越有利,如果不太了解,也可以通过电泳知道目标物质和杂质的情况,找到一种简单的鉴定方法,此外在纯化前必须先建立可靠的活性测定的方法。如果是未知的蛋白,那么通常可以有几种简单的摸索:

1. 凝胶过滤色谱。这个方法很常用,但是效率不高,对低浓度的样品没有富集作用,上样量小。
2. 离子交换色谱。此法很常用,但是样品必须没有高浓度的盐。
3. 疏水色谱。此法较好,它分离效率高,上样量大,特别适合分离盐析沉淀的样品。
4. 亲和色谱。是*的手段,关键了解目标物质的特性以便选择合适的亲和色谱填料。

二、主要用途介绍
1. 去除内毒素
内毒素也叫热源,一般是磷脂 A ,糖类和蛋白,在中性条件下带有负电荷。内毒素的磷脂部分有很强的疏水性,一般的在高盐情况下它们会聚合,所以不能用疏水色谱,如果蛋白本身的疏水性强,可以选择把目标蛋白结合到疏水色谱填料(苯基琼脂糖凝胶 FF ,丁基琼脂糖凝胶 FF )上和内毒素分离。
内毒素因为带有很强负电荷,如果目标蛋白带阳电荷,用 DEAE 琼脂糖凝胶 FF 或Q 琼脂糖凝胶 FF 把内毒素吸附,达到去除内毒素的目的。如果目标蛋白带阴电荷,可以尝试用阶段或梯度洗脱的方法把它们分离。

其中*而特异的方法是用亲和色谱填料去除内毒素,为此专门开发了两种专门去除内毒素的色谱填料,去内毒素琼脂糖凝胶 FF 和高效去内毒素琼脂糖凝胶 FF可以很方便去除内毒素,其应用简单,效果明显,样品回收率高。方法是把适量的色谱填料加到样品中 4 度震荡 40h 左右无菌过滤就可以得到热源符合要求的样品,或者直接装柱然后循环上样 8 小时左右即可。

2. 去除核酸
大量的核酸会使样品的粘度增加,影响传质从而影响分离效果,此外在药品检验中也对核酸的含量有严格的规定,所以去除核酸非常重要。
核酸带有阴性的电荷,可用阴离子交换色谱填料 DEAE 琼脂糖凝胶 FF 或 Q 琼脂糖凝胶 FF 去除,也可用阳离子色谱填料: SP 琼脂糖凝胶 FF 或 CM 琼脂糖凝胶FF 直接把目标蛋白吸附而去除核酸。在 2M 硫酸铵的条件下, RNA 和 DNA 都可以被苯基琼脂糖凝胶 FF 吸附。
此外也可以用核酸酶处理样品,把核酸降解成小片段,用凝胶过滤就可以去除。此外也可以本公司的 DNA 纯化琼脂糖凝胶 FF 去除。

3. 纯化硫酸铵沉淀样品
硫酸铵沉淀是很常用的初分离的手段,这样沉淀后的样品可直接用苯基琼脂糖凝胶FF 或者是丁基琼脂糖凝胶 FF 分离,不用除盐,非常方便。疏水色谱已经得到大规模的推广和应用,是很好的纯化的手段。此外疏水色谱也可以用于天然产物的分离纯化,包括多肽、色素等各种物质的分离纯化,它的分离原理和反相色谱相同,但是不同于硅胶色谱填料的是它对样品几乎没有死吸附,所以回收率高。

4. 糖蛋白的纯化
偶联各种凝集素的琼脂糖凝胶 FF 的亲和色谱填料可以分离各种糖蛋白,例如 Con A 琼脂糖凝胶 FF 可以纯化糖基化的蛋白,或者膜组分,甚至细胞等物质。此外硼酸琼脂糖凝胶 FF 也用来分离各种多糖和糖蛋白,其原理是苯硼酸类似于凝集素可以和各种糖基上的邻二羟基发生亲和作用。

5. 膜蛋白分离
有比较强的疏水性,可以用苯基或丁基琼脂糖凝胶 FF 疏水色谱分离,如果是有糖基结构或者受体等,也可以用亲和色谱的方法。

6. 纯化抗体和抗原
蛋白 A 琼脂糖凝胶 FF 可以用于分离纯化各种来源的抗体,包括抗血清、培养液以及腹水等样品。蛋白 A 可以特异吸附 IgG 的 Fc 区,所以它也适合分离酶解后的Fc 片段,把 Fab 片段和 Fc 段分离。同时蛋白 A 琼脂糖凝胶 FF 也可用于血清中IgG 的分离,得到不含抗体的血清,蛋白 A 琼脂糖凝胶 FF 有很好的稳定性,能耐受 37 度 3-5 天而对柱子的性能没有影响,是分离抗体的不错之选。

疏水色谱色谱填料苯基琼脂糖凝胶 FF 以及 DEAE 琼脂糖凝胶 FF 也场用于抗体的分离,只是特异性不如重组蛋白 A 琼脂糖凝胶 FF 好。

纯化 IgG 抗原*的办法是免疫亲和,具体的方法是把抗抗原的 IgG 直接偶联到环氧活化琼脂糖凝胶 FF 上,然后直接高 pH 吸附,低 pH 洗脱就可以得到需要的抗原。

对于高亲和力的抗体筛选,特别是小分子的半抗原,我们建议可以把半抗原偶联到环氧活化琼脂糖凝胶 FF ,把只和抗原结合的 IgG 分离,得到高亲和力的抗体,非常方便和实用,此外也可以选择氨基化琼脂糖凝胶 FF 或羧基化化琼脂糖凝胶 FF偶联半抗原,特别是对那些不适合用环氧活化琼脂糖凝胶 FF 偶联的半抗原。如果要偶联的是小分子的物质,需要用 11 个碳原子亲和手臂的活化好的填料,这样才能克服空间位阻得到最佳分离效果,如果是大分子的物质,那最好用 3 个碳原子亲和手臂的活化好填料就可以,这样栽量高,效果好。
IgM 和 IgY 可用吡啶琼脂糖凝胶 FF 亲和的方法把它们和杂蛋白分离。

7. 纯化重组蛋白
重组蛋白构建已经考虑到纯化的问题,大大简化了纯化的步骤,但还是会遇到些实际的问题,所以需要详细阅读使用说明和注意事项。

( 一 )HIS 标签重组蛋白可以很方便用镍琼脂糖凝胶 FF 分离,色谱填料已经螯合好了镍离子,使用非常方便,吸附载量更高,特异性更强,可以选择多种洗脱方式,是纯化这类融合蛋白的工具。

( 二 )ST 融合蛋白在表达时同时表达了谷胱/甘肽 s 转酶,很方便用 GST 琼脂糖凝胶 FF 分离,然后再用肠激酶或凝/血酶等酶解就得到表达的产物。而凝/血酶可以用肝素琼脂糖凝胶 FF 或苯甲脒琼脂糖凝胶 FF 分离。

( 三 ) 蛋白 A 融合蛋白可以用 IgG 琼脂糖凝胶 FF 分离。

( 四 ) 涵体蛋白的色谱复性 : 离子交换和疏水色谱都在包涵体复性中有很好的效果,金属螯合色谱填料等亲和色谱填料也常用于带 HIS 标签融合蛋白的色谱复性。

 

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