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技术支持

关于支原体标准品方法验证了解一下

更新时间:2022-06-09   点击次数:407次

支原体标准品

什么是支原体核酸法
支原体核酸法包括PCR和qPCR,通过检测支原体的特异核酸序列,以确定细胞上清或生物制品中是否存在支原体污染的一种方法。
由于支原体核酸法具有检测时间短(只需3-4h)、操作便捷等特点,越来越受到生物制品企业的青睐。

支原体核酸法可作为药典规定的培养法或DNA染色法的替代方法,或与以上方法相互补充。

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事实上,早在2011年,就有动物疫苗厂家在2011年第5期的《广东农业科学》上,报道了用德国Minerva Biolabs(简称MB)公司的支原体PCR试剂盒,用于检测疫苗中是否存在支原体的污染,它可与培养法互为补充,共同用于生产,为生产提供可靠的数据支持。

支原体标准品方法验证
支原体核酸法在用于放行检测之前,需先进行方法验证。欧洲药典和日本药典均要求核酸法需要在灵敏度、特异性和耐用性三个指标方面达到要求。

在灵敏度方面(又称最/低检测限),要求核酸法替代培养法,则灵敏度需达到10CFU/ml;核酸法替代DNA染色法,则灵敏度需达到100CFU/ml。

在特异性方面,欧洲药典和日本药典要求,核酸法要识别指/定的常见9种支原体,而不识别与支原体有近缘关系的菌属,如丙酮丁醇梭菌、嗜酸乳杆菌和肺炎链球菌,也不识别其他细菌和哺乳动物DNA。

在耐用性方面,欧洲药典要求检测结果不受方法参数的小的偏差的影响,如浓度的变化(MgCl2、引物、dNTP)、提取步骤的细微差别等。实际上这是强调结果的可靠性和稳定性,不受人为操作误差的影响。这可通过3轮不同时间段内的检测来实现,每轮进行8次重复检测,最后观察结果有什么变化。

在进行方法验证时,参比标准品是必/不可少的。著名微生物防控专家德国MB公司提供有一系列的支原体标准品和支原体DNA标准品,用于支原体核酸法的方法学验证。

Minerva Biolabs提供的标准品有三类:
灵敏度标准品
同时也用于耐用性验证。该标准品为冻干粉型的灭活支原体,这样不会造成实验室污染。原支原体来自英国NCTC菌种保藏中心,由于传代次数低,也很少发生突变。支原体经标准定量,有10CFU/管和100CFU/管可选。使用时用1ml与待测样本同样的基质液去溶解。之后进行支原体DNA抽提,再进行核酸法检测。如结果阳性,则表明最/低检测限能达到上述标准。

特异性验证用标准品
它包括支原体基因组DNA以及细菌基因组DNA,种属经测序验证。该标准品为10ng左右包装,为冻干粉型。用于PCR和qPCR方法对支原体物种的特异性检查,每种支原体DNA经测序验证,浓度经滴度测定。

PCR定量标准品
该标准品是经过严格定量的支原体DNA标准品,每管支原体基因组DNA的量为1×10^8基因组拷贝,用于10倍梯度稀释制备标准曲线,以对核酸法(主要是qPCR)的检测限进行精确定量,并可验证标准品浓度对数与Ct值的线性关系。
值得指出的是,欧洲药典和日本药典均要求先进行支原体DNA抽提,再进行核酸法检测。因此,方法验证实际上包括了核酸法的这两部分。

对于生物制品、细胞治疗产品的生产企业,在选用已经过厂家全面验证的支原体检测试剂盒之外,还需自己按照待测样本类型进行方法的适用性验证。

试剂盒的验证并不能代替包括操作过程在内的方法的适用性,操作、样本基质和仪器同样会对核酸法的技术指标产生不可忽视的影响。因此“对症下药”就显得尤为重要了。

 

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