蛋白质测序实验方法一览

Edman降解法

实验方法原理
主要有质谱法，利用蛋白质测序仪进行测序以及利用蛋白质对应DNA或mRNA进行间接测序。

传统的蛋白质测序实验一般包括以下步骤：
1.肽链的拆开和分离；
2.测定蛋白质分子中多肽链的数目；
3.二硫键的断裂；
4.测定每条多肽链的氨基酸组成，并计算出氨基酸成分的分子比；
5.N端、C端的测定；
6.多肽链断裂；
7.测定每个肽段的氨基酸顺序；
8.确定肽段在多肽链中的次序；
9.确定原多肽链中二硫键的位置。

实验材料
蛋白质样品
试剂、试剂盒
尿素 盐酸胍 巯基乙醇
仪器、耗材
蛋白质测序仪

实验步骤
1 多肽链的拆分。由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分，一般用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理蛋白质，分开蛋白质的多肽链。
2.测定蛋白质分子中多肽链的数目。通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。
3.二硫键的断裂。几条多肽链通过二硫键交联在一起，可在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用碘乙酸（烷基化试剂）保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。拆开后的肽链可用层析或电泳进行分离。
4.测定每条多肽链的氨基酸组成，并计算出氨基酸成分的分子比。可用于促进测序过程中的错误的发现或区分模糊结果。对某些氨基酸频率的了解也可用于选择用于蛋白质消化的蛋白酶。还可以确定低水平的非标准氨基酸（例如正亮氨酸）错误掺入蛋白质中。

（1）水解。通过将蛋白质样品在6mol/L 盐酸中加热至100-110℃24小时或更长时间来进行水解。具有许多庞大疏水基团的蛋白质可能需要更长的加热时间。一些氨基酸（丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，色氨酸，谷氨酰胺和半胱氨酸）可能被降解。为了解决这个问题，Biochemistry Online建议将不同时间的样品加热，分析每种产生的溶液，并推断回零水解时间。拉斯特尔建议使用各种试剂来预防或减少降解，例如硫醇试剂或苯酚，以保护色氨酸和酪氨酸免受氯的侵袭，并预氧化半胱氨酸。他还建议测量释放的氨的量以确定酰胺水解的程度。

（2）分离和定量。可以通过离子交换色谱法分离氨基酸，然后通过衍生化进行检测。另一种方法是将氨基酸衍生化，然后通过反相HPLC分离。

使用磺化聚苯乙烯作为基质进行离子交换色谱分析。在酸溶液中加入氨基酸并使稳定增加pH的缓冲液通过交换柱。当pH达到它们各自的等电点时，氨基酸被洗脱。一旦氨基酸被分离，通过添加将形成有色衍生物的试剂来确定它们各自的量。如果氨基酸的量超过10nmol，则可以用茚三酮，它与脯氨酸反应时呈黄色，与其他氨基酸发生鲜艳的紫色。氨基酸的浓度与所得溶液的吸光度成比例。非常少量或者低于10pmol的氨基酸，可以使用诸如邻苯二甲醛（OPA）或荧光胺的试剂形成荧光衍生物。

柱前衍生化可以使用Edman试剂产生的衍生物可通过UV光检测。使用产生荧光衍生物的试剂可以获得更高的灵敏度。将衍生化的氨基酸进行反相色谱，通常使用C8或C18 二氧化硅柱和优化的洗脱梯度。使用UV或荧光检测器检测洗脱的氨基酸，并将峰面积与衍生化标准品的峰面积进行比较，以量化样品中的每种氨基酸。

5.分析多肽链的N-末端和C-末端。
（1）N末端分析法：（2，4-二硝基氟苯（DNFB）法；异硫氰酸苯酯（PITC）法；丹黄酰氯（DNS）法；氨肽酶法）；
（2）C末端分析法（肼解法；酶降解法；硼氢化锂法）。

6.多肽链断裂成多个肽段。
分解肽链可通过内肽酶如胰蛋白酶或胃蛋白酶或通过化学试剂如溴化氰进行。不同的酶产生不同的切割模式，并且片段之间的重叠可用于构建整体序列。

7.测定每个肽段的氨基酸顺序
将待测序的肽段吸附在固体表面上（一种常见的基材是涂有聚苯乙烯（一种阳离子聚合物）的玻璃纤维），将异硫氰酸苯酯（PITC）与12％三甲胺的温和碱性缓冲溶液一起加入到吸附的肽中，与N-末端氨基酸的胺基反应。然后可以通过加入无水酸选择性地分离末端氨基酸。然后衍生物异构化得到取代的苯基乙内酰脲，其可以洗掉并通过色谱法鉴定，并且可以重复该循环。每个步骤的效率为约98％，允许可靠地确定约50个氨基酸。

序列测定也可以直接用蛋白质序列分析仪。将蛋白质或肽的样品固定在蛋白质测序仪的反应容器中并进行Edman降解。每个循环从蛋白质或肽的N-末端释放并衍生出一个氨基酸，然后通过HPLC鉴定释放的氨基酸衍生物。对整个多肽重复进行测序过程，直到建立整个可测量序列或预定数量的循环。

8.确定肽段在多肽链中的次序。
利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。

9.确定原多肽链中二硫键的位置
根据已知氨基酸顺序选择合适的专一性蛋白质水解酶（一般采用胃蛋白酶）在不打开二硫键的情况下部分水解蛋白质，再利用双向电泳技术分离出各个肽段，用过甲酸处理后，将可能含有二硫键的肽段进行组成及顺序分析，然后同其它方法分析的肽段进行比较，确定二硫键的位置。         

注意事项
1.样品纯度不能太低，经验认为纯度大于90%的蛋白才适用于测序反应。
2.N端封闭或糖基化的蛋白质难以进行Edman反应，无法测序。

其他的蛋白质测序方法还有：
1.可通过Edman降解确定的短蛋白质序列（10至15个残基）被翻译成DNA序列，用作探针或引物以分离相应基因或互补DNA的分子克隆。然后测定克隆DNA的序列并用于推断蛋白质的完整氨基酸序列。
2.蛋白质从头测序（De novo sequencing），又叫全新蛋白测序。这项技术是根据肽段与惰性气体相碰撞产生的一系列的有规律的片段离子之间的质量差来推断氨基酸序列。我们可以根据肽键断裂处的y离子和b离子来推测氨基酸序列，以及翻译后修饰。De novo sequencing有一项突出的优势，是传统质谱测序不能达到的，那就是不依赖任何蛋白质数据库，对未知蛋白质从头测序。