菌种保存过程中常见的一些问题

 分离纯化后才能获得单一菌株，单一菌株进行菌种保藏才有意义，防止菌种交叉污染和变异，这也是菌种保存的基本原则。

1、菌种保存管能保存霉菌及酵母菌吗？

答：可以。对于霉菌等真菌需培养7 天进行保存，而酵母菌需培养三天将孢子洗脱下来进行保存，保存管中的小瓷珠可以作为介质来吸附孢子和菌丝，相当于砂土保存法中砂土作为载体起到的作用。

2、所有的菌都能保存吗？如果不是的话，什么样的菌可以保存？什么样的菌不可以保存？

答：可以。菌种保存的原理是预防或减缓DNA 复制时自发突变导致菌种退化，因此要创造代谢不活泼的状态，而菌种保存时使菌种进入休眠态（孢子、芽孢)，并创造干燥、低温、缺氧、缺营养的环境，创造的环境越接近此状态，所保存的菌种的时间就越长，所以从原理上讲，所有菌种都可用这种方法保存， 但需要注意的是，苛刻菌（如流感嗜血杆菌、脑膜炎萘瑟氏菌）等特殊细菌保存时，需-80℃或更低温度保存，才可以做到更长期的保存。

3、能用菌种保存管永/久保存菌株吗？

答：温度越低，保藏效果越好。从目前的试验数据及实际保存效果来看，-20℃可保存1-5 年，-80℃或液氮中可保存5-10 年，不同菌种及不同的保存温度保存时间会有所不同（例如：大肠、沙门等常规细菌-20℃我们目前可以保存到6年）。但需要注意的是所保存的菌种需每年抽检进行生化特征的鉴定，确定菌株无变异。

4.菌株保存的是第三代，-80℃保存，再取出来活化的话属于第几代？

答：保存的是第三代复活出来后，如果采用平板或肉汤活化相当于转接了一代，就是第四代了，如果还在瓷珠里的话就还是原来的代数。如果是保存在斜面上，这一支斜面一直就是第三代，如果转接到另一支斜面就是第四代了。传代原则，菌株活化复苏不论以任何形式繁殖了一次就算是传了一代。但如果仅是物理位置的转移没有繁殖就不是传代，需要注意。

5.刚买回来的阳性菌株是第0代吗？

答：一般菌株你买回来的时候上面都会写明第几代，常规来说都是第0代的。像购买的ATCC或CICC的冻干粉都是标记为0代的。

6.菌株传代保存到瓷珠里一定要挑单菌落吗？

答：不一定非挑单菌落，但是一定要挑相同特征的菌落，就是说从同一个菌落纯化出来的，以保证它们的特性*一致。原则是尽量多挑，宁多勿少。

7.怎样延长菌株的保存时间呢？

大量的实验证明菌株在低温、干燥、缺氧、缺营养的条件下保存效果是最/好的，越接近这种保存条件，菌株的保存时间越长。

8.怎样纯化菌株？

纯化就是从TSA上或别的非选择性平板上转接一次，这就相当于纯化了。

9. 我们保存的一代菌株是不是要重新传代保存呢，认证老师会不会认为这是个错误？

答：应该不会，认证老师不会提出这种问题的，不过最好是一代菌株保存一些、二代菌株保存一些，使用时工作菌株最好使用第三代菌株，一代菌株可作为长期保存用。

10. 为何要将第三代作为工作菌株？

答：多传代几次后菌株的活力会明显提高，但最多传代到第五代后就不能用了，因为第五代后菌株虽然不会*变异，但变异率会明显增加，因此选用第三代作为工作菌株是比较合适的，若使用第一、第二代菌株活力没有那么强。

11.用瓷珠管反复上下摇匀，有泡沫不容易吸出来，怎么办？

答：不必特别剧烈大尺度的摇动瓷珠管，稍微上下晃动就可以；如果确实有泡沫的话可以静置一会，让菌株多吸附一下瓷珠也是可以的。

12. TSA斜面一般多少度保存，可以放在冷藏里吗？

答：2-8℃保存，放在冷藏是可以的；注意弧菌和绿脓杆菌要放到室温20-25℃保存，否则会很快死亡。

13.如果TSA斜面放在冷冻里面，会有什么影响？

答：琼脂冷冻后性状会发生改变，会变得很软，结构发生改变，所以不建议冷冻；如果要冷冻的话就采用甘油保存法或瓷珠保存法。

14.用瓷珠管保存产气荚膜梭菌老是保存不好！做好瓷珠管之后瓷珠管要放到厌氧袋里面再放到-20℃么？

答：如果冷冻保存最好放在厌氧袋里再-20°保存，保存效果还可以；或者可以采用庖肉培养基保存，它是一种液体培养基，将产气荚膜梭菌接进去然后2-8 ℃保存，可以保存一年没有问题，在厌氧环境下保存效果最/好。

15、菌种保藏时为什么要进行分离纯化？

答：分离纯化后才能获得单一菌株，单一菌株进行菌种保藏才有意义，防止菌种交叉污染和变异，这也是菌种保存的基本原则。

16、菌种保存管对于平板来说，对挑选菌落个数有要求吗？还是将整个平板的菌落全部刮入管中？

答：对于要保存的细菌一般是要进行2-3 次的纯化，要保证一个平板上的菌是由单一菌落传代而来的，所以在细菌保存的过程中，为了保证制备的菌悬液可以达到3-4MCF，是可以将整个平板的的细菌全部刮到管中的，如果平板长的比较满一般半个平板就够用，具体用量也根据菌种的不同有所差异，如霉菌、酵母菌在保存时，不适合用浊度法。

17、对于液体培养基培养的纯菌，是否也可以用咱们的菌种保存管？如果可以的话，怎么操作？

答：是可以用的，如果液体培养基能保证是纯菌的话，可以直接离心，弃掉上清，然后把保存管中液体吸进去充分混匀，然后再转移到菌种保存管中，整个过程要注意无菌操作。不过，一般菌种保存管最好选择平板菌落进行保存，因为液体培养基中有杂菌是不易观察出来的。

18、为什么在菌种保存时，要上下颠倒？为什么不能旋摇？

答：上下颠倒，可使菌悬液充分混匀，菌株充分、均匀地吸附到小瓷珠上，旋摇不利于菌悬液充分混匀,反而会使菌株全部沉淀于管底。

19、为什么在使用时要将管内的液体尽可能多的吸出？

答：吸出液体可避免反复冻融形成的冰晶对菌株的损伤，加快复苏的过程，因此，要尽可能的将与菌种混匀后的保存液吸净。而常用的甘油法，在复苏的过程中需用水浴锅快速溶解，在此过程中，对菌株伤害较大。

20、在使用后，菌种保存管的保存环境？需要-80℃冰箱吗？

答：远慕生物菌种保存管采用的是低温冷冻保存法，因此，使用后，需放置低温环境，如-20℃、-80℃或液氮中保存，而且温度越低，保存效果越好。用户需根据菌种的保存要求选择具体保存温度。

21、为什么说，如果有条件的话，菌种保存管最好置于-80 冰箱或液氮中？

答：因为，贮存在-70℃以下低温中能减少冰晶形成，可极大降低冰晶形成对细菌的伤害，同时可为被保存的菌种创造更低的代谢环境，从而延长细菌保存的时间。

22.菌株保存是-70℃还是-80℃有具体标准规定么？

答：其实是有标准的，《SN/T 2632-2010 微生物菌株常规保藏技术规程》是关于菌株保藏的一个标准，大家可以学习一下，各个保存方式都有介绍，但是瓷珠是比较新兴的保存方式暂时里面还没有收录。

23、为什么在取用菌株时，操作过程要求快速？

答：菌种保存复苏的原则，要求慢冻快融，之所以要求快速，是因为在菌种复苏的过程中, 长时间的溶解过程会对所保存的菌种造成损伤，而我们经过改良的保存方法最/大程度的避免复苏所造成的影响，但我们还是建议遵循菌种的保存复苏原则，保证所复苏菌种的复苏率。

24、将菌株反复冻存，到底对菌株有什么影响？

答：低温会使菌株细胞内的水分形成冰晶，从而引起细胞结构尤其是细胞膜的损伤。细胞体积大者一般要比较小者对低温更为敏感，而无细胞壁者则比有细胞壁者敏感。如果放到低温（不是一般冰箱）进行冷冻时，会产生冰晶，冰晶呈针状，极易导致细菌的严重损伤。用电镜观察，可见细菌的核膜上有大量针尖样小孔，当从低温下移出并开始升温时，冰晶又会变大，故反复冻存，会对菌株造成极大损伤。