远慕生物浅谈：稳转株构建及其单克隆化应用要点

稳转株是指通过基因工程手段获得稳定过表达或抑制特定基因的细胞株。一般将目的基因序列或抑制目的基因的shRNA序列装载至重组载体中，再通过慢病毒系统或转座子系统将目的序列整合至宿主细胞的染色体中，实现目的基因持续、稳定的调控。

通过慢病毒系统或转座子系统转染并经过药物筛选获得的阳性细胞是一个混合细胞池，即多克隆细胞系。单克隆细胞系则是从多克隆细胞系中分选得到的，由单一细胞扩增得到的细胞株。稳转株细胞系是科研工作者常用的基因调控细胞模型，常规的科研实验，多克隆细胞系是可以满足需求的，但某些应用场景需要稳转株单克隆化。今天与大家一起回顾稳转株与其单克隆化的应用要点。

一、什么时候需要构建稳转株呢？

长期在目的细胞中研究基因的功能

部分蛋白半衰期极长，瞬时RNA只能干扰表达，无法去除已经表达的目的蛋白，想要实现更好的基因干扰效果

需要用诱导表达系统的，主要是一些致死基因或者是需要时空表达的

需要用细胞做动物实验的，比如裸鼠成瘤等

需要进行药物筛选、构建重组蛋白、生产制备抗体和报告细胞系等也需要构建稳转株

二、单克隆化的优点与必要性

药物筛选获得的多克隆细胞系由单克隆细胞株组成的。由于慢病毒整合位点与拷贝数的不确定性导致各个单克隆基因组存在异质性，使每个单克隆的目的基因表达水平和细胞表型也不相同。不经过单克隆化而继续传代培养，由于各单克隆的生长速度不一致（目的基因表达较低的克隆增殖速度较快），会存在生长优势抑制的问题，传代多次以后高表达目的基因的单克隆会逐渐消失，出现多克隆稳转株因多次传代而表达量逐渐下降的现象。因此，单克隆化可以提高稳转株基因组的均一性和表型的稳定性。

一般情况下，多克隆稳转株是可以满足我们的科研需求的，比如初步验证基因功能，其优点是节省了单克隆化的时间与经济成本。但得出的数据稳定性与重复性往往欠佳，如果想减少实验的波动，提高实验的可重复性，展现更加严谨的实验数据，则需要单克隆化。此外，用于工业生产的稳转株一般都需要进行单克隆化。工业生产中需要保证生产工艺和质量稳定可控，因此需要通过单克隆化将细胞库的异质性降至最/低。此外，还有一些特殊的情况需要单克隆化。比如由于不同细胞系与目的基因自身生物学的特性，会存在转染效率低、表达效率过低或过高，构建得到的多克隆稳转株中只有个别克隆的符合表达需求，此时则需要进行单克隆化分选合适的细胞系。

三、单克隆化的方法

单细胞分离方法中，常见的有限稀释法（limiting dilution cloning, LDC）和流式细胞术分选法等。此外，克隆筛选单细胞打印系统、ClonePix高通量细胞克隆筛选系统和细胞成像技术等新技术也逐渐用于细胞单克隆化或确认单克隆性，有效提高筛选的效率和精度。

★有限稀释法：

该方法是将混合细胞池以一定梯度进行稀释，再以0.5cell/孔或以下的要求进行铺板。该方法是现今最/常用的，具有操作简单、对设备要求较低等优点。但依赖人工操作，耗时久、效率低、花费大量的96或384孔板等缺点也需要关注。并且筛选得到的克隆只是基于稀释比例得到的理论单克隆，难以确定所选细胞是单克隆。该方法通过结合成像系统技术，记录每个单孔中的克隆初始状态和生长情况，则可以提高有限稀释法的精度。

★流式细胞荧光分选技术：

依据细胞的大小、细胞内含物复杂程度、细胞内所含的荧光染料、细胞表面膜蛋白等参数，可以通过流式细胞仪从多克隆细胞池中分选出单克隆。一般可以分选下列两种情况的细胞，一是在慢病毒载体中插入了荧光标记，转染后细胞内表达荧光蛋白，并通过其进行分选。第二种是过表达某种蛋白于细胞膜表面，此时用带有荧光标记的抗体进行孵育，再通过流式进行分选。使用流式细胞仪分选单细胞，单克隆形成率高，并且可以与单克隆成像系统连用，确定单克隆。

四、总结

稳转株是研究基因功能和生物医药生产应用的重要细胞工具，且稳转株单克隆化可有效提高细胞系的均一性。我们可以根据实际需求，考虑是否单克隆化。