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技术支持

单个核细胞的分离纯化方法

发布时间:2022-10-19   点击次数:333次

外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)主要指淋巴细胞和单核细胞,是免疫学实验最/常用的细胞,也是进行T细胞和B细胞分离纯化的重要环节。

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1.原理

PBMC的密度与血液中的其他成分不同。红细胞和粒细胞的密度较大,为1.092左右;淋巴细胞和单核细胞的密度为1.076~1.090;血小板为1.030~1.035。因此,利用一种密度介于1.076~1.090之间、近于等渗的溶液(分层液)进行密度梯度离心,可使不同类别的血细胞按其相应密度分布,从而被分离。

2.方法

1)聚蔗糖-泛影葡胺分层液法 聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-hypaque,F-H)分层液为密度梯度离心法最/常用的分离液,其主要成分是聚蔗糖和泛影葡胺。聚蔗糖 (Ficoll) 分子量为40kD,具有高密度、低渗透压、无毒性的特点;常用的Ficoll溶液浓度为6%,密度为1.020。泛影葡胺 (Hypaque) 用来增加密度,适量加入密度为1.200、浓度为34%的Hypaque于Ficoll溶液中,配成密度为1.077±0.001的分层液,称为淋巴细胞分层液,用于淋巴细胞的分离。

分离细胞时,将肝素抗凝全血叠加在分层液上,使两者形成一个清晰的界面。水平离心后,形成不同层次的液体和细胞区带,从而分离出PBMC (图1)。红细胞和粒细胞密度大于分层液,同时因红细胞遇Ficoll而凝集成串钱状,沉积于分层液底部;血小板因密度小而悬浮于血浆中;PBMC的密度稍低于分层液,故位于血浆层和分层液的界面中,呈白膜状。吸出单个核细胞,计数,用台盼蓝染色检查细胞活力。

本法分离单个核细胞的纯度可达95%,细胞获得率达80%以上,细胞活性达95%以上小鼠淋巴细胞的比重与人淋巴细胞比重不同,若分离小鼠淋巴细胞应选用小鼠淋巴细胞分离液,比重1.092±0.001。

2)Percoll分层液法

Percoll是经过聚乙/烯吡/咯烷酮 (polyvinyl pyrolidone, PVP) 处理的硅胶颗粒混悬液,对细胞无毒性和刺激性。Percoll混悬液的硅胶颗粒大小不一,经过高速离心后,可形成一个连续密度梯度,将比重不同的细胞分离纯化。

将1份10XPBS与9份Percoll贮存液混合,制成等渗Percoll悬液,此悬液被认为是100%Percoll悬液,其密度为1.1294g/ml。用PBS或细胞培养液稀释100%Percoll而获得所需密度的Percoll分离液用于相应细胞的分离。若分离淋巴细胞应使用1.0777g/ml,配制时用稀释液稀释60%即可。

取比重1.077的Percoll分离液X ml与离心管中,将等倍稀释的抗凝血1/2 X ml 小心叠加在分离液上,经水平离心(1500rpm)后,便得四个细胞层,从而分离出淋巴细胞。表层为死细胞残片和血小板,底层为粒细胞和红细胞,中间有两层,上层富含单核细胞,下层富含淋巴细胞。

该法是纯化淋巴细胞和单核细胞的一种较好的方法,淋巴细胞纯度高达98%,单核细胞纯度可达78%。 

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