核酸浓度测定的五种方法介绍

　　1、定磷法

　　核糖核酸（RNA）含磷量约为9.5%，脱氧核糖核酸（DNA）含磷量约为9.2%，采用定磷法可准确测出磷含量，进而折算出样品中核酸含量。

　　原理：在酸性条件下，定磷试剂中的钼酸铵以钼酸形式与样品中的磷酸反应生成磷钼酸，当还原剂存在时磷钼酸立即转变为蓝色的还原产物——钼蓝；钼蓝最大的刚吸收在650-660nm波长处，根据吸光值制作标准曲线，从而确定核酸的浓度。测定范围在1-10μg

　　优缺点：简单、快速；但易受蛋白与核苷酸的影响。

　　2、 定糖法

　　原理：核糖中的戊糖可在浓盐酸或者浓硫酸作用下脱水生成醛类化合物可与某些成色剂缩合成有色化合物，可用比色法或者分光光度法测定其溶液中的吸收值，在一定的浓度范围内，溶液的吸收值与核酸的含量成正比。

　　RNA浓度的测试：RNA与浓盐酸共热时发生降解，产生的核糖又可转变为糠醛，在FeCl3或CuCl2催化下，糠醛与3，5-二羟基甲苯（苔黑酚）反应形成绿色复合物，生成的绿色化合物在670nm处有最大的吸收值。测定范围在20~250μg

　　DNA浓度的测定：脱氧核糖核酸中的脱氧核糖在酸性环境中变成戊醛与二苯胺试剂一起加热产生蓝色化合物，生成的蓝色的化合物在595nm处有最大吸收值。测定范围在20~250 μg

　　优缺点：较灵敏，但特异性较差

　　3、 紫外吸收法（分光光度法、Nanodrop）

　　组成核酸分子的碱基，由于含有芳香环结构，具有紫外吸收的特性。吸收值在波长250-270nm之间，最大吸收波长是260nm。一般1μg/ml

　　RNA溶液在1cm光径比色皿中的光吸收峰值约为0.022，1μg/ml

　　DNA溶液的光吸收值为0.020。因此测定未知浓度RNA或DNA溶液在260nm的光吸收值即可计算出其中核酸的含量。

　　4、 荧光光度法

　　专门配套的荧光检测技术，只有与DNA、RNA或蛋白质结合后才发出荧光的染料。这些荧光染料只有与特异性的靶分子结合时才能发出荧光信号，采用荧光染料检测特定目标分子的浓度，可以对DNA和RNA进行精准定量。

　　优缺点：灵敏，简便；价格昂贵

　　5、 qPCR法

　　使用荧光定量方法中的绝对定量，配套标准品，制作对应的标准曲线，使用荧光定量仪，计算对应的荧光值并转换对应的核酸浓度。

　　优缺点：灵敏度高，误差小；操作时间长