单抗的标记技术详细介绍

　　目前动物用单抗，在动物疫病诊断和检疫、妊娠检测、性别鉴定等方面有广泛的应用，大多以诊断试剂(盒)的形式提供，其中核心试剂为标记的单抗。下面远慕将介绍常用的几种标记技术。

　　1．酶标记

　　(1)辣根过氧化物酶(HRP)标记辣根过氧化物酶(HRP)标记单抗和多克隆抗体的常用方法是过碘酸钠法。其原理是HRP的糖基用过碘酸钠氧化成醛基，加入抗体IgG后该醛基

　　与IgG氨基结合，形成Schiff氏碱。为了防止HRP中糖的醛基与其自身蛋白氨基发生偶合，在用过碘酸钠氧化前先用二硝基氟苯阻断氨基。氧化反应末了，用硼qin化钠稳定Schiff氏碱。

　　这里介绍两种程序。

　　程序一：

　　①将5mg HRP溶于0．5mL 0．1mol／L NaHCO3溶液中；加0．5mL 10mmol／L NaIO4溶液，混匀，盖紧瓶塞，室温避光作用2h。

　　②加0．75mL 0．1mol／L Na2CO3混匀。

　　③加入0．75mL小鼠已处理的腹水，或纯化单抗等(15mg／mL)，混匀。

　　④称取Sephadex G25干粉0．3g，加入一支下口垫玻璃棉的5mL注射器外简内；随后将上述交联物移入注射器外套；盖紧，室温作用(避光)3h或4℃过夜。

　　⑤用少许PBS将交联物全部洗出，收集洗出液，加1／20体积新鲜配制的5mg／mL NaBH4溶液，混匀，室温作用30min；再加入3／20体积NaBH4溶液，混匀，室温作用1h(或4℃过夜)。

　　⑥将交联物过Sephadex G200或Sepharose 6B(2．6cm×50cm)层析纯化，分管收集第一峰。

　　⑦酶结合物质量鉴定：

　　克分子比值测定

　　酶量(mg／mL)=OD403×0．4

　　IgG量(mg／mL)=(OD280—OD403×0．3)×0.62

　　克分子比值(E／P)=酶量×4／IgG量，一般在1～2

　　酶结合率=酶量×体积／抗体

　　标记率一般为0．3～0．6，即1～2个HRP分子结合在一个抗体分子上，标记率可大于0．6，0．8，0．9；OD403／OD280等于0．4时，E／P约为1。

　　标记率=OD403／OD280

　　酶活性和抗体活性的测定可应用ELISA法、免疫扩散、DAB—H2O2显色反应测定酶结合物的酶活性，抗体活性及效价、特异性。

　　⑧HlRP抗体结合物的保存：加入等量甘油后，小量分装一20℃存放，防止反复冻融；或加入等量60％甘油4℃保存；不宜加。NaN3或酚防腐，否则会影响酶活性。必要时冻干保存，以BSA或脱脂牛奶作保护剂。

　　程序二；

　　①将5mg HRP溶于0．3mol／L  pH8．1 NaHCO3溶液中，加入1％二硝基氟苯无水乙醇溶液0．1mL，室温搅拌作用1h，以封闭HRP分子上的a和ε氨基。

　　②再加1mL 0．06mo1／L过碘酸钠溶液，在室温中避光轻搅30min，溶液呈黄绿色；随后加1mL 0．06mol／L乙二醇，轻搅1h，中止氧化反应。

　　③移入透析袋中，在1000mL 0．01moI／L pH9．5碳酸盐缓冲液中，4℃透析过夜，更换三次缓冲液，注意避光。

　　④吸取上述醛化好的HRP溶液3mL，加入5mgIgG的碳酸盐缓冲液1mL，室温轻搅2～3h，避光；加入5mgNaBH4，4℃放置3h或过夜，或换用乙醇胺(2mol／L  pH9．5)0．2mL，作用7h。

　　⑤再移入透析袋中，在0．02mol／L  pH7．4  PBS中透析24h，更换3次缓冲液。

　　⑥用3000r／min离心30min，除去沉淀物。上清液再用半饱和硫酸铵盐析3次，沉淀用少许PBS溶解，透析或层析除盐，必要时进一步层析纯化。

　　其余步骤同程序一⑦⑧。

　　(2)碱性磷酸酶(AP)标记碱性磷酸酶(AP)用于标记抗体，常用戊二醛一步法，将酶和单抗混合，再加入适量戊二醛，使酶和抗体蛋白的NH2分别与两个醛基结合，制备成缔合物。该法简便，但所得产物不均一，抗体活性损失大，酶标记率低。其程序如下：

　　①将5mgAP加入1mL抗体溶液(2mg／mL)中溶解，装入透析袋，于4℃对0．01mol／L  pH7．2PBS透析18h，换液3次。

　　②加入2．5%戊二醛20μL，室温作用1～2h，4℃对PBS透析过夜，其间换液3次。

　　③换用0．05mol／L  pH8．0 Tri-PHCl缓冲液透析，4℃过夜，换液3次。

　　④取出标记抗体，用含1％ BSA的 Tris—HCl缓冲液稀释至4mL，即为AP标记物原液。

　　⑤每毫升中加入0．4mL甘油，小量分装，保存备用。

　　(3)PAP、APAAP的制备PAP(过氧化物酶～抗过氧化物酶桥联酶标技术)、APAAP(碱性磷酸酶一抗碱性磷酸酶桥联酶标技术)的制备对于日益广泛使用单抗的免疫细胞化学有重要意义。现在已有商品化的小鼠、大鼠、豚鼠、山羊、绵羊和兔PAP、APAAP试剂供应，只要配以相应的桥抗体，即可非常便利地应用单抗。因为PAP法和APAAP法不用任何化学交联剂处理酶和抗体，它们的活性均不受化学因素的影响，提高了敏感性和特异性。PAP和APAAP试剂的制备方法常采用先将HRP或AP加入抗HRP或AP的抗血清或单抗中而获得免疫沉淀物，再加入酶盐水．过量的酶有助于免疫沉淀物的解离反应，调pH至2.3，随后立即中和，除去不溶解的沉淀物后，加入半饱和硫酸铵，纯化PAP或APAAE。艰据需要还可将PAP和APAAP试剂先与相应桥抗体结合后，再与特定单抗组成完整的诊断试剂，这样，单抗即可一步法用于诊断或检测试验等。

　　2．荧光素标记

　　(1)异硫氰酸荧光素(FITC)标记FITC标记抗体的原理是在碱性条件下，FITC的异硫氰基能与IgG的自由氨基结合，形成IgG与荧光素的结合物。FITC是常用的荧光素，其次选用TRITC(四甲基异硫氰酸罗丹明)。FITC和TRITC是常用的双标记组合。其标记步骤如下：

　　①以碳酸盐缓冲液(pH9．3，Na2CO3  8．6g，NaHCO3 17．3g，蒸馏水1000mL)凋整抗体浓度至10mg／mL。

　　②取5mL抗体溶液置于10mL小烧杯中。

　　③称取1mg FITC溶于0．2mL  DMSO中，待溶解后立即缓慢滴加于抗体液内，边加边轻搅；其后室温避光作用2h。

　　④将交联物经SephadexG25或G50柱层析除去游离的荧光素；分管收集第一峰为标记的抗体。

　　⑤FITC的结合物质量鉴定

　　IgG量(mg／mL)=(OD280—OD495×0．35)／1．4

　　F／P=2．87×OD495／(OD280一OD495×0.35)

　　一般来说，FITC对抗体的摩尔比为3；1时适合于组织切片染色，为(5~6)：1时适合于细胞悬液染色。以标记抗体染色各种抗原，测定其特异性染色滴度和非特异染色的程度。

　　⑥标记抗体的保存：宣保存于4℃，加NaN3防腐。

　　(2)异硫氰酸罗丹明(TRITC)标记基本与FITC标记相同。

　　3．同位素标记

　　必须强调的是在使用同位素标记单抗或其他蛋白之前，应掌握同位素操作和防护知识。

　　正常情况下应包括避免物理的接触和对r-射线照射的有效保护，操作和使用同位素标记抗体时，应利用防护装置，并合理处置含放射性的废料。

　　(1)碘标记用碘标记抗体是一种有效的标记方法。l25I衰变产生低能的γ和X射线，很容易被检测出来，而其60d的半衰期保证足够的有效使用期，且能很方便地处理放射废料。

　　常用的碘标记方法是氯胺T法，即将氧化剂氯胺T加入抗体和碘化物的溶液中，Na125I在氯胺T作用下I转化成I2，游离、I2可与抗体分子中酪氨酸和一些组氨酸发生卤化反应，用还原剂和游离酪氨酸终止反应，经凝胶过滤将标记的抗体与碘化酪氨酸及还原剂分离开。其主要操作步骤如下：

　　①在进行标记之前，先选用截流分子质量为20000~50000的凝胶，制备1mL凝胶柱，然后分别用10倍体积的1％BSA／PBS／0．02％叠氮钠和PBS洗涤柱体，封住柱下口，备用。

　　②加入10μg纯化单抗至含有25μL  2．5mol／L磷酸钠(pH7．5)的1．5mL指形管内。随后，加入500μCi Na125I混匀。

　　③加入25μL新配制的2mg／mL氯胺T。室温放置60s。再加入50μL氯胺T终止液(含2．4mg／mL偏重亚硫酸钠，10mg／mL酪氨酸，10％甘油和0．1％环乙烷酰二甲苯的PBS)。

　　④将上述碘标记物上样在凝胶柱表面，小心放开柱体下口，用1．5mL指形管收集。当碘标记物全部进入柱体，加入0．3mL含0．03％叠氮钠的PBS，用另一指形管收集0．3mL，然后再加0．3mL 0．03％  NaN3 PBS，下口收集0．3mL，重复进行，同时用同位素检测仪测定标记与未标记的单抗。标记抗体在第二至第四管出现。无害化处理柱子和非单抗标记部分。

　　⑤将标记单抗保存于4℃可使用6周。

　　(2)生物合成法标记将杂交瘤细胞培养在含有放射性前体的培养基中，随着抗体分子的合成、组装，同位索会标记在抗体分子的初级氨基酸链上，本方法不会导致抗体活性的丧失。

　　其主要步骤是：

　　①离心收集处于对数生长期的杂交瘤细胞，需2×106个细胞。以预热37℃不含甲硫氨酸的培养基洗涤上述细胞。

　　②用含2％PBS不含甲硫氨酸的培养基悬浮杂交瘤细胞至106个／mL，加入35S甲硫氨酸(每次加入100μ Ci可产生105～106cpm的抗体)。

　　③经CO2培养箱中培养过夜，离心后，吸出培养上清液，分别加入1／20体积的1mol／L Tris(pH8．0)及叠氮钠至浓度0．02％。该标记抗体可按纯化单抗方法进行。

　　4．生物素标记

　　生物索标记反应常用生物索琥珀酰亚胺酯进行。生物素是与抗体分子的游离赖氨酸等发生偶联反应而完成标记。其主要步骤是：

　　(1)用二甲基亚砜配制10mg／mL的N羟琥珀酰亚胺生物素(应根据需要选用不同大小和间臂长的生物索化琥珀酰酯)。

　　(2)用硼酸钠缓冲液(0．1mol／L，pH8．0)稀释单抗溶液至1～3mg／mL。

　　(3)每毫克抗体加入25～250μg的生物索酯，混匀后，室温作用4h。

　　(4)按每250μg生物素酯加入20μL  1mol／LNH4Cl终止反应，室温放置10min。

　　(5)以PBS充分透析除去游离生物素，标记抗体冻存。

　　5．其他标记技术

　　适用于蛋白质的其他标记方法也可用于单抗，如胶体金标记、化学发光标记、SPA标记、铁蛋白标记等