乙醇固定样品DNA抽提和直接PCR实验

　　实验概要

　　本实验从乙醇浸泡的鱼苗中提取DNA，并利用直接PCR进行了鉴定。

　　实验原理

　　在实际的研究工作中，野外取样的地点一旦较为偏远，受条件的限制，很难保证得到的样品活体或能够快速冷冻；另外，对一些稀有物种和濒危种，鲜活样品的采集十分困难，一般为了解决这些问题，常采用乙醇和甲醛固定的方法来处理样品，再对样品DNA 进行提取以及扩增。使用乙醇固定样品具有硬化，固定，脱水作用，对组织渗透迅速，特别适合组织中核酸的保存，相比于甲醛等其它固定方法，此法更简单，保存时间更长质量更好，也更加清洁无害。乙醇固定样品主要应用于水产种质资源鉴定，医院或兽医病理样品保存，法医样品保存等方面，在特定物种基因保护，生物多样性，动物分子标记，司法鉴定等方面有广泛的应用。

　　Omega Bio-Tek 相应试剂盒既能够快速有效的抽提得到乙醇保存多年的样品基因组DNA，又可以利用直接PCR 系统，快速的对乙醇保存样品进行PCR 鉴定，为您的研究提供最有力的工具。

　　实验材料

　　乙醇浸泡的鱼苗

　　实验步骤

　　1. E.Z.N.A. Tissue Direct PCR kit

　　1) 分别取45ul AT1 和5ul AT2 到0.2ml PCR 管中，混合均匀。对于有较多样品需要操作的，可以先将AT1 和AT2 用量计算好，混合均匀后再分装到每一管中。

　　2) 取鱼苗一条，在AT4 中浸泡约5-10min，滤纸吸干水份。

　　3) 将鱼苗浸没在上一步准备的AT1 中56℃水浴或者PCR 仪上消化10-20min，中间可以涡旋混匀一次。

　　4) 消化完后的PCR 管置于90℃水浴或者PCR 仪上5min，稍微冷却后加入50ul AT3 涡旋混匀。

　　5) 以上裂解液就可以作为PCR 的模板直接使用，PCR 体系中建议加入5ul 左右。

　　6) 取5ul E.Z.N.A. Tissue Direct PCR kit 抽提得到的一条鱼苗的DNA 作为模板，客户提供的引物Y-30-R/F 作为引物，PCR 扩增。

　　7) PCR 扩增程序：

　　94℃ 2min；

　　94℃ 30S 52℃ 30S 72℃ 40S 33cycles；

　　72℃ 5min；

　　25℃ forever。

　　2. E.Z.N.A.? MicroElute? Genomic DNA Kit

　　1) 称量10mg 组织，加入200ul Buffer TL；

　　2) 加20ul OB，55℃孵化至wan全降解；

　　3) 13,000xg 离心2min，转移上清至新管；

　　4) 加220ul Buffer BL 涡旋混匀，70℃孵化10min；

　　5) 加220ul 无水乙醇，最大速度涡旋15s；

　　6) 将混合液过柱吸附，13,000xg 离心30-60s，弃滤液；

　　7) 加500ul Buffer HB，离心；

　　8) 700ul DNAWash Buffer（加乙醇）；

　　9) 13,000xg 离心2min，干燥柱子；

　　10) 加25ul 70℃预热的Elution Buffer 洗脱。