琼脂扩散试验(单向和双向)操作步骤

实验概要

可溶性抗原与相应抗体在半固体琼脂凝胶内扩散，二者相遇，在比例合适处形成白色沉淀。基本类型有单向扩散和双向扩散两种。本文介绍了单向和双向两种琼脂扩散试验的操作流程。单向琼脂扩散试验主要用于检查血清中各种免疫球蛋白和补体成份的含量；双向琼脂扩散试验可用来分析和鉴定标本中多种抗原或抗体成份，并用以测定抗原或抗体的效价。

实验原理

1. 单向琼脂扩散试验是一种定量试验，将抗体混合于琼脂内，倾注于玻片或平皿上，凝固后在琼脂上打孔，再将抗原标本加入孔内，经过一定的时间，在孔的周围出现抗原抗体复合物形成的沉淀环，环的大小与抗原含量和扩散时间相关。用不同浓度的抗原制成标准曲线，则未知标本中的抗原含量即可从准标曲线中求出。

2. 抗原和抗体加到琼脂板上相对应的孔中，两者各自向四周扩散，如两者相对应，浓度比例合适，则经一定时间后，在抗原、抗体孔之间出现清晰致密的白色沉淀线。每一抗原与其相对应抗体只能形成一条沉淀线，若同时含有若干对抗原抗体系统，因其扩散速度的不同，可在琼脂中出现多条沉淀线。且根据沉淀线融合情况，还可鉴定两种抗原是wan全相同还是部分相同。

实验步骤

1. 单向琼脂扩散试验(Single immunodiffusion test)-人血清中IgG、IgA、IgM的测定

1) 材料

IgG、IgA、IgM免疫板、参考血清、待检血清、微量加样器(10微升)、量尺、纱布、生理盐水、带盖方盘。

2) 方法

a. 免疫琼脂板制备：将1.5%琼脂(用PH8.2、0.05M的巴bi妥缓冲液配成)，加热溶化，待琼脂冷至56℃加入适量抗血清(抗血清最终稀释度取决于抗血清所标化的稀释度)，混匀，制成厚1.5mm的琼脂板，待琼脂凝固后打孔，孔径为3mm，孔距1～1.2cm。

b. 稀释参考血清及待检血清：参考血清用0.5ml蒸馏水溶解后使用，参考血清、待检血清稀释按要求进行。

c. 加样：将上述稀释参考血清分别滴入相应的抗体免疫板的一排孔内，其余孔滴加待检的稀释血清，每个检样加两个孔，每孔滴加10微升。

d. 扩散：将免疫板置水平湿盘内，放进37℃温箱，IgG免疫板扩散24小时，IgA、IgM板48小时后取出置黑色背景前观察结果，(如果沉淀环不清晰，也可用1%鞣酸液浸泡免疫板半小时后观察)，必要时可以染色后观察。

e. 绘制标准曲线及血清标本中IgG、IgA、IgM定量测定：测量沉淀环直径。沉淀环直径的大小除与抗原量相关，还与分子量和扩散时间有关。这种沉淀环直径与抗原含量的关系不是直线相关，而是对数关系，这种关系有两种计算方法：

Mancini曲线－适用于大分子抗原和长时间扩散(＞48小时)的结果处理。使用方格计算纸划线，沉淀环直径的平方与抗原浓度呈线性关系。公式表示：C／d2 ＝K(C＝抗原浓度，d＝沉淀环直径，K＝常数)。

Fehey曲线－适用于小分子抗原和较短时间(24小时)扩散的结果处理。使用半对数纸划线，浓度的对数与沉淀环之间呈线性关系。公式表示：logC／d＝K(C＝抗原浓度，d＝沉淀环直径，K＝常数)。

2. 双向琼脂扩散试验(Double immunodiffusion test)

1) 材料

羊抗人全血清，小牛血清，正常人混合血清，精制琼脂粉，生理盐水、载玻片，打孔器(直径3mm)、湿盒、吸管等。

2) 方法

a. 用生理盐水配制1.0～1.5%琼脂，隔水煮沸使溶化，用吸管吸取3.5ml趁热浇于载玻片上，制成琼脂板。

b. 待琼脂凝固后，按右图用打孔器打孔，并用针头挑去孔中琼脂(孔距为5mm)。

c. 在①孔中加正常人混合血清，在②孔中加小牛血清，③孔中加羊抗人全血清，注意不要溢出。

d. 将加好样品的琼脂板置于湿盒内，于37℃温箱内放置24小时后观察结果。