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Solution I, 250ml质粒相关溶液

  • 型   号:PS001
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上海古朵生物供应Solution I, 250ml质粒相关溶液 上海古朵生物是一家集研发、销售为一体的高新技术生物企业,公司专注于生命科学和生物技术领域,专业提供分子生物学、免疫学、生命科学基础研究以及临床检测等诸多领域的试剂、耗材、仪器等各类产品及生物技术服务。

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上海古朵生物供应Solution I, 250ml质粒相关溶液 上海古朵生物是一家集研发、销售为一体的高新技术生物企业,公司专注于生命科学和生物技术领域,专业提供分子生物学、免疫学、生命科学基础研究以及临床检测等诸多领域的试剂、耗材、仪器等各类产品及生物技术服务。

 

Solution I, 250ml质粒相关溶液  原理:

其中用到三种溶液以及硅酸纤维膜(超滤柱)。 溶液Ⅰ:50 mM葡萄糖 / 25 mMTris-HCl/ 10 mMEDTA,pH 8.0;溶液Ⅱ:0.2 N NaOH / 1%SDS; 溶液Ⅲ:3 M 醋酸钾/ 2 M 醋酸/75%酒精。

溶液Ⅰ

葡萄糖是使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部;EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂,其主要目的是为了螯合二价金属离子从而达到抑制DNase的活性;可添加RNase A消化RNA。

溶液Ⅱ

此步为碱处理。其中NaOH主要是为了溶解细胞,释放DNA,因为在强碱性的情况下,细胞膜发生了从双层膜结构向微囊结构的变化。SDS与NaOH联用,其目的是为了增强NaOH的强碱性,同时SDS作为阴离子表面活性剂破坏脂双层膜。这一步要记住两点:*,时间不能过长,因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断也会慢慢断裂;第二,必须温柔混合,不然基因组DNA会断裂。

溶液Ⅲ

溶液III的作用是沉淀蛋白和中和反应。其中醋酸钾是为了使钾离子置换SDS中的钠离子而形成了PDS,因为十二烷基硫酸钠(sodium dodecylsulfate)遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾 (potassium dodecylsulfate, PDS),而PDS是不溶水的,同时一个SDS分子平均结合两个氨基酸,钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了。2 M的醋酸是为了中和NaOH。基因组DNA一旦发生断裂,只要是50-100 kb大小的片断,就没有办法再被 PDS共沉淀了,所以碱处理的时间要短,而且不得激烈振荡,不然最后得到的质粒上总会有大量的基因组DNA混入,琼脂糖电泳可以观察到一条浓浓的总DNA条带。75%酒精主要是为了清洗盐份和抑制Dnase;同时溶液III的强酸性也是为了使DNA更好地结合在硅酸纤维膜上

 

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